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新虫 (初入文坛)

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[求助] PMD19-T载体连接不上428bp的片段

使用TAKARA的PMD19-T载体，连接428bp大小的片段。用的感受态是DH5α。体系是solution1 5微升，19-T 1微升，片段浓度16ng/ul，用4ul。反应时间是16℃下2小时。片段是KOD酶扩出来的，切胶回收后又用Tag酶加A，再切胶回收后用于连接的。感受态活力良好，为什么涂板之后菌落特别少，就算有也是蓝斑多。挑过几个白斑，用M13引物扩，显示没有连上。为什么啊？

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1楼 2012-04-17 09:52:09

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honinglee

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
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西瓜: 金币+3, 鼓励交流！技术在进步，咱不能老抱着旧东西，呵呵~ 2012-04-17 19:26:49

对还纠结于T-载连接这种小问题的童鞋我深表同情，曾经的我浪费了大量的时间在载体构建上，现在想想这些逝去的时间都痛心，几年过去了，现在好多带致死基因的PCR克隆载体十分好用，别再用那些蓝白筛选的载体了，耗时费力。用个好点的酶，推荐FERMENTAS的，3000KB以下不用测序的，用个带致死基因的载体（许多选择，英骏的，FERMENTAS的，全式金的，多的很，一般都不是太贵），15分钟室温连接后直接转化，一般会长出十来个菌落，基本都是阳性克隆。挑菌直接下一步实验即可，会省不少时间的。强烈建议！需要具体货号站内直接PM我。

希望采纳，别在载体构建上耗费太多时间。