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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PMD19-T载体连接不上428bp的片段
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sunwei57

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
连接428bp大小的片段不用高保真的酶,随便一个酶就可以,使用TAKARA的PMD19-T载体稀释10倍取1微升,片断4微升反应时间是16℃过夜
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

630384464
11楼2012-04-18 09:44:26
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
片段浓度太低吧
还有T载体加的太多，像你这里加0.1的T载就够
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勤奋、执着、专注，则无坚不破。
12楼2012-04-18 10:52:15
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630384464

新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
11楼: Originally posted by sunwei57 at 2012-04-18 09:44:26:
连接428bp大小的片段不用高保真的酶,随便一个酶就可以,使用TAKARA的PMD19-T载体稀释10倍取1微升,片断4微升反应时间是16℃过夜

好的。我去试试看。
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13楼2012-04-18 19:12:08
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630384464

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by gjs713 at 2012-04-18 10:52:15:
片段浓度太低吧
还有T载体加的太多，像你这里加0.1的T载就够

恩。我会去试试看的。
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14楼2012-04-18 19:12:30
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630384464

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by honinglee at 2012-04-17 16:58:40:
对还纠结于T-载连接这种小问题的童鞋我深表同情，曾经的我浪费了大量的时间在载体构建上，现在想想这些逝去的时间都痛心，几年过去了，现在好多带致死基因的PCR克隆载体十分好用，别再用那些蓝白筛选的载体了，耗 ...

哎。。。老师为了节约成本。感受态也是自制的。。。以后工作了可能好点。
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15楼2012-04-18 19:15:53
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123gyf002

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助，今天很活跃哦 2012-04-19 13:49:43
Taq没扩增不出来，只有两种可能：引物不行和模板质量不行；你的情况应该是模板质量不行（其它酶能扩出来），模板稀释10倍再用，还不行的话，从头提模板吧
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16楼2012-04-18 22:08:35
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syn1985

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-19 13:49:53
片段浓度不用测 只要你在回收前看取5ul上样条带亮就肯定能连上 如果你必须要你那个酶扩增的话 我建议你一次多做几管 先用DNA产物回收盒回收产物 然后再加A 然后切胶回收 我一直这么做 从没有问题 祝好运
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17楼2012-04-19 12:45:14
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yanhua_2006

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
直接用Taq酶进行PCR扩增，然后切胶回收直接用来进行T载体连接，pMD19载体我用过，16℃连接过夜，时间稍微长一点儿， 应该没有什么问题的。我觉得可能连接时间有点短。
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18楼2012-04-20 09:49:03
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王雨云

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感觉楼主连接时间确实有点短，一般都是16度过夜连接
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19楼2012-04-20 17:01:35
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xjtu0025

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

照例说400多片段,taq酶应该是毫无压力呀..你是不是taq酶失火了...
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20楼2013-05-20 08:52:36
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