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新虫 (初入文坛)

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[求助] PMD19-T载体连接不上428bp的片段

使用TAKARA的PMD19-T载体，连接428bp大小的片段。用的感受态是DH5α。体系是solution1 5微升，19-T 1微升，片段浓度16ng/ul，用4ul。反应时间是16℃下2小时。片段是KOD酶扩出来的，切胶回收后又用Tag酶加A，再切胶回收后用于连接的。感受态活力良好，为什么涂板之后菌落特别少，就算有也是蓝斑多。挑过几个白斑，用M13引物扩，显示没有连上。为什么啊？

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1楼 2012-04-17 09:52:09

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引用回帖:

10楼: Originally posted by honinglee at 2012-04-17 16:58:40:
对还纠结于T-载连接这种小问题的童鞋我深表同情，曾经的我浪费了大量的时间在载体构建上，现在想想这些逝去的时间都痛心，几年过去了，现在好多带致死基因的PCR克隆载体十分好用，别再用那些蓝白筛选的载体了，耗 ...

哎。。。老师为了节约成本。感受态也是自制的。。。以后工作了可能好点。