应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » T载体连接不上去
271/1返回列表
查看: 6323  |  回复: 26
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

fanwq258

木虫 (正式写手)

[交流] T载体连接不上去

自己扩增的基因，连接T载体就是连不上，但是买载体时带的插入片段可以连接上，这可该怎么办呢？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2013-08-05 09:53:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有1个 )

flyhigh805

金虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
amisking: 金币+5, 感谢发帖应助，帮助虫子 2013-08-05 18:28:46
amisking: 回帖置顶 2013-08-05 18:28:48
你的目的片段大小是多少啊，太大的话连T载可能有点困难，但是只要优化连接条件连上去应该很容易的。应尝试提高PCR产物的浓度，可以取少量PCR产物电泳检测如果大小正确的话剩下的PCR产物直接过胶回收的柱子，这样得到的PCR产物浓度高，另外增加连接时间16℃过夜或4℃过夜。
赞一下 回复此楼
5楼2013-08-05 17:16:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

gyesang

荣誉版主 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你是什么酶扩出来的片段，如果是高保真酶的话，你考虑加A尾了吗？
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2013-08-05 13:35:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuminzorro

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-10 14:19:36
你的pcr产物特异性如何，如果没有非特异性条带的话，不要纯化直接连接，我2周前遇到和你类似的情况，不纯话直接连就没问题，我用的是全日金的T1载体，4ul产物+1ul载体。你可以试试看，希望对你有帮助哦！
赞一下(1人) 回复此楼
17楼2013-08-09 22:45:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

fanwq258

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-08-05 13:35:34
你是什么酶扩出来的片段，如果是高保真酶的话，你考虑加A尾了吗？

不是高保真的酶，用的就是宝生物普通的ex taq
赞一下 回复此楼
3楼2013-08-05 14:51:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hyphen007

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
考虑下连接条件、片段大小及各种成分的量
赞一下 回复此楼
4楼2013-08-05 15:24:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fanwq258

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by flyhigh805 at 2013-08-05 17:16:03
你的目的片段大小是多少啊，太大的话连T载可能有点困难，但是只要优化连接条件连上去应该很容易的。应尝试提高PCR产物的浓度，可以取少量PCR产物电泳检测如果大小正确的话剩下的PCR产物直接过胶回收的柱子，这样得到 ...

我的目的片段也就是800多，浓度在25ng/UL左右，买载体是带的片段也就700多bp，浓度是50ng/UL，我就是按照自带片段的浓度加的，可是就是连接不上
赞一下 回复此楼
6楼2013-08-05 18:43:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wswsjz

木虫 (职业作家)
祝福，祝福，顶起来，抢顶楼！
回复此楼
7楼2013-08-05 19:00:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

123n

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
用的什么T载体？建议调整一下片段的浓度。。
赞一下 回复此楼
8楼2013-08-05 21:48:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

追梦草

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fanwq258(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-08 10:30:49
浓度再提高些，16度再多连会，会更有可能连上。我前一阵刚连上3900bp的片段，PCR产物胶回收柱浓度为400ng/ul，16度连了14h.
赞一下 回复此楼
9楼2013-08-05 23:02:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

duoyidian

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fanwq258(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-08-08 10:30:57
一般是反应的时间不够，链接的条件的一般不会差多少的
赞一下 回复此楼
10楼2013-08-06 13:54:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-08-08 10:31:02
调整比例，延长链接时间，考虑采用solution 1链接一下试试
赞一下 回复此楼
11楼2013-08-06 15:25:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

54808455

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-08 09:57:42
QIAGEN公司的研发专家发现，PCR引物5’端的碱基（也就是引物第一个碱基）的不同，会影响PCR产物的连接效率！检查下你的引物。
赞一下 回复此楼

» 本帖附件资源列表

  • 欢迎监督和反馈：小木虫仅提供交流平台，不对该内容负责。
    本内容由用户自主发布，如果其内容涉及到知识产权问题，其责任在于用户本人，如对版权有异议，请联系邮箱：xiaomuchong@tal.com
  • 附件 1 : IncreasingefficiencyofcloningPCRproducts.pdf
    • 2013-08-07 18:28:12, 67.27 K
13楼2013-08-07 18:28:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-08-08 09:57:50
真的假的啊？你连了几次失败啊？不就是DNA纯化产物4微，T-VECTOR 1微，solution 1   1微嘛！So easy!
赞一下 回复此楼
14楼2013-08-07 21:42:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lqbzfun

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-08-08 10:30:39
赶紧去丁香园的试用中心申请个无缝克隆的试剂盒
赞一下 回复此楼
15楼2013-08-07 22:15:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cookee1981

银虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
估计是没有带A尾
赞一下 回复此楼
16楼2013-08-08 10:43:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

flyhigh805

金虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by fanwq258 at 2013-08-05 18:43:10
我的目的片段也就是800多，浓度在25ng/UL左右，买载体是带的片段也就700多bp，浓度是50ng/UL，我就是按照自带片段的浓度加的，可是就是连接不上...

建议按照我上面所说的方法提高目的片段的浓度
赞一下 回复此楼
18楼2013-08-10 17:03:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaihong1983

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
连不上是什么意思？是没有菌落长出来还是，有单菌落，但是鉴定后发现不是？
如果是没有菌落，那你的PCR产物是什么酶P出来的，如果是高保真酶，你的PCR产物加T处理了吗？没加T肯定连不上。
如果有很多菌落，但是鉴定后不是，那你的PCR产物是做的胶回收吗？如果没做胶回收直接连的话，很容易连上的都是引物二聚体。
赞一下 回复此楼
19楼2013-08-16 13:18:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lifajun1976

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
把PCR的产物浓度做大点，就没问题
赞一下 回复此楼
20楼2013-08-16 15:30:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xingjiuwcc

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
PCR最后一步72℃7分钟有吗，没有就不行了。。。。
赞一下 回复此楼
21楼2013-08-16 18:00:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lijia2054224

金虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
fanwq258: 金币+7 2013-08-22 15:36:24
现在已经做出来了吧，哈哈，你那么聪明
赞一下 回复此楼
22楼2013-08-22 15:33:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

随缘棒棒糖

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
9楼: Originally posted by 追梦草 at 2013-08-05 23:02:13
浓度再提高些，16度再多连会，会更有可能连上。我前一阵刚连上3900bp的片段，PCR产物胶回收柱浓度为400ng/ul，16度连了14h.

想请问您一下您的连接比例，我的目的片段3000-3500之间，连接做了一个月，没有结果。各种体系，比例，连接时间都尝试了，依然没成功。请不吝指教。
赞一下 回复此楼
23楼2013-08-23 11:28:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

追梦草

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
23楼: Originally posted by 随缘棒棒糖 at 2013-08-23 11:28:51
想请问您一下您的连接比例，我的目的片段3000-3500之间，连接做了一个月，没有结果。各种体系，比例，连接时间都尝试了，依然没成功。请不吝指教。...

我也是连了好几次才连上的。。。没有计算连接比例，我觉得尽量提高PCR产物回收的浓度和16度连接时间，连上的可能性会变大。还有转化最好做对照，保证感受态细胞，水浴锅的温度等都没问题，我们水浴锅的温度与我用温度计测的差3度…我感觉连长片段还要靠点运气，祝你好运。
赞一下 回复此楼
24楼2013-08-24 11:37:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

93wbj

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
9楼: Originally posted by 追梦草 at 2013-08-05 23:02:13
浓度再提高些，16度再多连会，会更有可能连上。我前一阵刚连上3900bp的片段，PCR产物胶回收柱浓度为400ng/ul，16度连了14h.

请问你用的胶回收试剂盒是哪家的啊。我的胶回收序列太低了。
赞一下 回复此楼
25楼2016-05-19 18:33:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

何何y

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
17楼: Originally posted by yuminzorro at 2013-08-09 22:45:32
你的pcr产物特异性如何，如果没有非特异性条带的话，不要纯化直接连接，我2周前遇到和你类似的情况，不纯话直接连就没问题，我用的是全日金的T1载体，4ul产物+1ul载体。你可以试试看，希望对你有帮助哦！

你好，我也在用全式金的载体，目标片段3000多，怎么也连不上。不知道什么原因
赞一下 回复此楼
26楼2017-12-14 11:55:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小熊长大了

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
26楼: Originally posted by 何何y at 2017-12-14 11:55:41
你好，我也在用全式金的载体，目标片段3000多，怎么也连不上。不知道什么原因...

您好，请问您TA克隆做出来了吗？从年前做到现在一直没出来
赞一下 回复此楼
27楼2018-03-09 14:57:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
简单回复
piaofu12楼
2013-08-06 15:58   回复  
相关版块跳转 我要订阅楼主 fanwq258 的主题更新
271/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 085700资源与环境308求调剂 +6 墨墨漠 2026-03-18 6/300 2026-03-20 00:02 by 23Postgrad
[考研] 286分人工智能专业请求调剂愿意跨考！ +3 lemonzzn 2026-03-17 3/150 2026-03-19 23:58 by 23Postgrad
[考研] 材料学硕318求调剂 +5 February_Feb 2026-03-19 5/250 2026-03-19 23:51 by 23Postgrad
[考研] 085600材料与化工 求调剂 +14 enenenhui 2026-03-13 15/750 2026-03-19 21:53 by allen-yin
[考研] 复试调剂 +4 z1z2z3879 2026-03-14 6/300 2026-03-19 17:18 by fei626-918
[考研] 【考研调剂】化学专业 281分，一志愿四川大学，诚心求调剂 +5 吃吃吃才有意义 2026-03-19 5/250 2026-03-19 16:18 by 30660438
[考研] 271材料工程求调剂 +6 .6lL 2026-03-18 6/300 2026-03-19 15:41 by haoshis
[考研] 一志愿天津大学化学工艺专业（081702）315分求调剂 +11 yangfz 2026-03-17 11/550 2026-03-19 15:06 by houyaoxu
[考研] 324分 085600材料化工求调剂 +3 llllkkkhh 2026-03-18 3/150 2026-03-19 14:22 by houyaoxu
[考研] 求调剂，一志愿:南京航空航天大学大学 ，080500材料科学与工程学硕，总分289分 +3 @taotao 2026-03-19 3/150 2026-03-19 14:07 by peike
[考研] 070300化学319求调剂 +6 锦鲤0909 2026-03-17 6/300 2026-03-18 13:22 by Iveryant
[考研] 312求调剂 +8 陌宸希 2026-03-16 9/450 2026-03-18 12:39 by Linda Hu
[考研] 0703化学求调剂 总分331 +3 ZY-05 2026-03-13 3/150 2026-03-18 10:58 by macy2011
[考研] 材料，纺织，生物（0856、0710），化学招生啦 +3 Eember. 2026-03-17 9/450 2026-03-18 10:28 by Eember.
[考研] 277调剂 +5 自由煎饼果子 2026-03-16 6/300 2026-03-17 19:26 by 李leezz
[考研] 085601求调剂 +4 Du.11 2026-03-16 4/200 2026-03-17 17:08 by ruiyingmiao
[考博] 26申博 +4 八6八68 2026-03-16 4/200 2026-03-17 13:00 by 轻松不少随
[考研] 一志愿南京大学，080500材料科学与工程，调剂 +4 Jy? 2026-03-16 4/200 2026-03-17 11:02 by gaoqiong
[考研] 22408总分284求调剂 +3 InAspic 2026-03-13 3/150 2026-03-15 11:10 by zhq0425
[考研] 294求调剂 +3 Zys010410@ 2026-03-13 4/200 2026-03-15 10:59 by zhq0425
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭