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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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zr1140861173

铁虫 (小有名气)

[求助] 目的基因与载体连接问题

我PCR的目的基因4600bp,想直接去连接载体pPIC3.5k(大概9000bp),按照正常的连接过程一直都连接不上,各位有谁做过类似的实验吗,求帮助啊!!!!!!
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这是我自己选择的道路,我不需要怜悯,亦没必要动摇,生也是我,死也是我,胜固欣然,败也从容
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dnacomputer

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-28 14:57:24
载体太大了,换个小载体试试。克隆成功以后再转到这个大载体中

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2013-11-28 14:56:14
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zhuht1983

新虫 (初入文坛)

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励新虫发帖交流,欢迎常来! 2013-11-28 18:03:34
本帖内容被屏蔽

3楼2013-11-28 16:57:20
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guoyanfei

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-29 14:14:06
PCR片段有点大,你试着把链接体系中的目的片段量降低,降到跟载体差不多或者稍微比载体量多一些,延长链接时间;另外要确保载体和片段酶切充分,并且酶切位点正确,不要有星活性出现;
4楼2013-11-29 08:41:51
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anning529

禁虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

5楼2013-11-29 14:21:57
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
按正常程序连的话,应该也是没有问题的,不知道你一直都连接不上,走的是什么过程
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
6楼2013-11-29 14:41:11
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dang_qi

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
两个太大的确不太好连,我之前做过4K+5K
建议质粒进行两次单酶切,时间可以长一点
还有就是坚持,太大了没办法
手指所触碰到的距离必有你所期待的风景.
7楼2013-11-30 17:13:18
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8楼2013-11-30 17:31:09
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recca1016

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

不知道楼主的问题解决了没有,这个我经验比较多,楼主可以参考下
无论大小片段连接,最重要的就是片段浓度和纯度。
如果PCR片段的杂带不是太多,建议不要切胶,直接将pcr产物过纯化kit,酶切,再直接连接;载体也是一样,如果低拷贝的质粒浓度不高,可以过量酶切之后直接纯化,连接。
PCR片段可以适当加的比例高一些。

祝你好运。
流水不腐,户枢不蠹
9楼2013-12-06 16:22:47
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