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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 目的基因与载体连接问题
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zr1140861173

铁虫 (小有名气)

[求助] 目的基因与载体连接问题

我PCR的目的基因4600bp，想直接去连接载体pPIC3.5k（大概9000bp），按照正常的连接过程一直都连接不上，各位有谁做过类似的实验吗，求帮助啊！！！！！！
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这是我自己选择的道路，我不需要怜悯，亦没必要动摇，生也是我，死也是我，胜固欣然，败也从容
1楼 2013-11-28 14:49:26
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dnacomputer

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-28 14:57:24
载体太大了，换个小载体试试。克隆成功以后再转到这个大载体中

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2013-11-28 14:56:14
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zhuht1983

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励新虫发帖交流，欢迎常来！ 2013-11-28 18:03:34
本帖内容被屏蔽
3楼2013-11-28 16:57:20
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guoyanfei

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-29 14:14:06
PCR片段有点大，你试着把链接体系中的目的片段量降低，降到跟载体差不多或者稍微比载体量多一些，延长链接时间；另外要确保载体和片段酶切充分，并且酶切位点正确，不要有星活性出现；
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4楼2013-11-29 08:41:51
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anning529

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
5楼2013-11-29 14:21:57
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
按正常程序连的话，应该也是没有问题的，不知道你一直都连接不上，走的是什么过程
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
6楼2013-11-29 14:41:11
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dang_qi

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
两个太大的确不太好连，我之前做过4K+5K
建议质粒进行两次单酶切，时间可以长一点
还有就是坚持，太大了没办法
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手指所触碰到的距离必有你所期待的风景.
7楼2013-11-30 17:13:18
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baowanrui110
8楼2013-11-30 17:31:09
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recca1016

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

不知道楼主的问题解决了没有，这个我经验比较多，楼主可以参考下
无论大小片段连接，最重要的就是片段浓度和纯度。
如果PCR片段的杂带不是太多，建议不要切胶，直接将pcr产物过纯化kit，酶切，再直接连接；载体也是一样，如果低拷贝的质粒浓度不高，可以过量酶切之后直接纯化，连接。
PCR片段可以适当加的比例高一些。

祝你好运。
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流水不腐，户枢不蠹
9楼2013-12-06 16:22:47
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