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判官小艾

木虫 (正式写手)

读研有时候需要的是勇气

[交流] 表达载体和目的片段链接问题已有3人参与

载体是用的puc18目的片段式未知的(细菌基因组经sau3AI酶切的)要求片段大小是4-10kb的,链接是4度48H
链接体系是10ul T4ligase 5xbuffer 链接后电转用的感受态是大肠杆菌knabc一个耐盐缺陷株,电转电压时2500v 时间是4-5ms,但是板上就是没有阳性菌落,求给点建议,做了3个月了还没有进展
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就让那流水带走光阴的故事
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不叶珏

铁杆木虫 (正式写手)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 鼓励发贴积极交流。 2013-11-26 19:18:49
puc18 质粒太小 建议换个大容量质粒
借你一生好不好
2楼2013-11-25 13:52:30
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判官小艾

木虫 (正式写手)

读研有时候需要的是勇气

引用回帖:
2楼: Originally posted by 不叶珏 at 2013-11-24 17:52:30
puc18 质粒太小 建议换个大容量质粒

师兄师姐都是用的这个载体,能得到阳性菌株
就让那流水带走光阴的故事
3楼2013-11-25 19:40:58
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guoyanfei

金虫 (小有名气)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2013-11-26 19:18:59
建议换成化学转化方法,因为电转化有一定的缺陷,我曾经也做过克隆的,电转化做了一个冬天还没成功,最后是用的化学转化法,就一次就成功了。希望对你有所帮助。
4楼2013-11-26 09:02:23
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判官小艾

木虫 (正式写手)

读研有时候需要的是勇气

引用回帖:
4楼: Originally posted by guoyanfei at 2013-11-25 13:02:23
建议换成化学转化方法,因为电转化有一定的缺陷,我曾经也做过克隆的,电转化做了一个冬天还没成功,最后是用的化学转化法,就一次就成功了。希望对你有所帮助。

化转也做了但是很难得到阳性菌落,化转效率低,不如电转效率高,电转对感受态细胞影响较大,要求较高,我再摸摸试试。谢谢您
就让那流水带走光阴的故事
5楼2013-11-26 10:02:56
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guoyanfei

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-27 01:45:40
引用回帖:
5楼: Originally posted by 判官小艾 at 2013-11-26 10:02:56
化转也做了但是很难得到阳性菌落,化转效率低,不如电转效率高,电转对感受态细胞影响较大,要求较高,我再摸摸试试。谢谢您...

你用的是CaCl2法吗?建议你用KCM法,我们建库度是用的KCM法,电转化很容易污染,对感受态细胞杀伤力很大,假阳性率有时候很高,很难排除问题的所在。另外,你可以改变条件连接一下,22度连接6h,4度连接24h,你试试看,只要酶切没问题,连接转化一般不会有问题的。
6楼2013-11-26 11:30:20
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判官小艾

木虫 (正式写手)

读研有时候需要的是勇气

引用回帖:
6楼: Originally posted by guoyanfei at 2013-11-25 15:30:20
你用的是CaCl2法吗?建议你用KCM法,我们建库度是用的KCM法,电转化很容易污染,对感受态细胞杀伤力很大,假阳性率有时候很高,很难排除问题的所在。另外,你可以改变条件连接一下,22度连接6h,4度连接24h,你试试 ...

我做感受态是这样的。4度收集菌体,用去离子水洗涤菌体,然后用10%的甘油悬浮后离心,最后用1ml的10%的甘油悬浮菌体即可,所有的操作都在冰上进行的
就让那流水带走光阴的故事
7楼2013-11-26 21:02:51
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by guoyanfei at 2013-11-26 11:30:20
你用的是CaCl2法吗?建议你用KCM法,我们建库度是用的KCM法,电转化很容易污染,对感受态细胞杀伤力很大,假阳性率有时候很高,很难排除问题的所在。另外,你可以改变条件连接一下,22度连接6h,4度连接24h,你试试 ...

能够详细说下KCM 法?
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
8楼2013-11-27 01:46:05
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