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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 表达载体和目的片段链接问题
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判官小艾

木虫 (正式写手)

读研有时候需要的是勇气

[交流] 表达载体和目的片段链接问题 已有3人参与

载体是用的puc18目的片段式未知的（细菌基因组经sau3AI酶切的）要求片段大小是4-10kb的，链接是4度48H
链接体系是10ul T4ligase 5xbuffer 链接后电转用的感受态是大肠杆菌knabc一个耐盐缺陷株，电转电压时2500v 时间是4-5ms,但是板上就是没有阳性菌落，求给点建议，做了3个月了还没有进展
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就让那流水带走光阴的故事
1楼 2013-11-25 10:43:56
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不叶珏

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
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myprayer: 金币+1, 鼓励发贴积极交流。 2013-11-26 19:18:49
puc18 质粒太小 建议换个大容量质粒
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借你一生好不好
2楼2013-11-25 13:52:30
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判官小艾

木虫 (正式写手)

读研有时候需要的是勇气
引用回帖:
2楼: Originally posted by 不叶珏 at 2013-11-24 17:52:30
puc18 质粒太小 建议换个大容量质粒

师兄师姐都是用的这个载体，能得到阳性菌株
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就让那流水带走光阴的故事
3楼2013-11-25 19:40:58
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guoyanfei

金虫 (小有名气)
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-11-26 19:18:59
建议换成化学转化方法，因为电转化有一定的缺陷，我曾经也做过克隆的，电转化做了一个冬天还没成功，最后是用的化学转化法，就一次就成功了。希望对你有所帮助。
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4楼2013-11-26 09:02:23
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判官小艾

木虫 (正式写手)

读研有时候需要的是勇气
引用回帖:
4楼: Originally posted by guoyanfei at 2013-11-25 13:02:23
建议换成化学转化方法，因为电转化有一定的缺陷，我曾经也做过克隆的，电转化做了一个冬天还没成功，最后是用的化学转化法，就一次就成功了。希望对你有所帮助。

化转也做了但是很难得到阳性菌落，化转效率低，不如电转效率高，电转对感受态细胞影响较大，要求较高，我再摸摸试试。谢谢您
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就让那流水带走光阴的故事
5楼2013-11-26 10:02:56
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guoyanfei

金虫 (小有名气)
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-27 01:45:40
引用回帖:
5楼: Originally posted by 判官小艾 at 2013-11-26 10:02:56
化转也做了但是很难得到阳性菌落，化转效率低，不如电转效率高，电转对感受态细胞影响较大，要求较高，我再摸摸试试。谢谢您...

你用的是CaCl2法吗?建议你用KCM法，我们建库度是用的KCM法，电转化很容易污染，对感受态细胞杀伤力很大，假阳性率有时候很高，很难排除问题的所在。另外，你可以改变条件连接一下，22度连接6h，4度连接24h，你试试看，只要酶切没问题，连接转化一般不会有问题的。
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6楼2013-11-26 11:30:20
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判官小艾

木虫 (正式写手)

读研有时候需要的是勇气
引用回帖:
6楼: Originally posted by guoyanfei at 2013-11-25 15:30:20
你用的是CaCl2法吗?建议你用KCM法，我们建库度是用的KCM法，电转化很容易污染，对感受态细胞杀伤力很大，假阳性率有时候很高，很难排除问题的所在。另外，你可以改变条件连接一下，22度连接6h，4度连接24h，你试试 ...

我做感受态是这样的。4度收集菌体，用去离子水洗涤菌体，然后用10%的甘油悬浮后离心，最后用1ml的10%的甘油悬浮菌体即可，所有的操作都在冰上进行的
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就让那流水带走光阴的故事
7楼2013-11-26 21:02:51
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
★
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6楼: Originally posted by guoyanfei at 2013-11-26 11:30:20
你用的是CaCl2法吗?建议你用KCM法，我们建库度是用的KCM法，电转化很容易污染，对感受态细胞杀伤力很大，假阳性率有时候很高，很难排除问题的所在。另外，你可以改变条件连接一下，22度连接6h，4度连接24h，你试试 ...

能够详细说下KCM 法？
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
8楼2013-11-27 01:46:05
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