应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 表达载体和目的片段链接问题
81/1返回列表
查看: 1954  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

判官小艾

木虫 (正式写手)

读研有时候需要的是勇气

[交流] 表达载体和目的片段链接问题 已有3人参与

载体是用的puc18目的片段式未知的（细菌基因组经sau3AI酶切的）要求片段大小是4-10kb的，链接是4度48H
链接体系是10ul T4ligase 5xbuffer 链接后电转用的感受态是大肠杆菌knabc一个耐盐缺陷株，电转电压时2500v 时间是4-5ms,但是板上就是没有阳性菌落，求给点建议，做了3个月了还没有进展
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
就让那流水带走光阴的故事
1楼 2013-11-25 10:43:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

不叶珏

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 鼓励发贴积极交流。 2013-11-26 19:18:49
puc18 质粒太小 建议换个大容量质粒
赞一下 回复此楼
借你一生好不好
2楼2013-11-25 13:52:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

判官小艾

木虫 (正式写手)

读研有时候需要的是勇气
引用回帖:
2楼: Originally posted by 不叶珏 at 2013-11-24 17:52:30
puc18 质粒太小 建议换个大容量质粒

师兄师姐都是用的这个载体，能得到阳性菌株
赞一下 回复此楼
就让那流水带走光阴的故事
3楼2013-11-25 19:40:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

guoyanfei

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-11-26 19:18:59
建议换成化学转化方法，因为电转化有一定的缺陷，我曾经也做过克隆的，电转化做了一个冬天还没成功，最后是用的化学转化法，就一次就成功了。希望对你有所帮助。
赞一下 回复此楼
4楼2013-11-26 09:02:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

判官小艾

木虫 (正式写手)

读研有时候需要的是勇气
引用回帖:
4楼: Originally posted by guoyanfei at 2013-11-25 13:02:23
建议换成化学转化方法，因为电转化有一定的缺陷，我曾经也做过克隆的，电转化做了一个冬天还没成功，最后是用的化学转化法，就一次就成功了。希望对你有所帮助。

化转也做了但是很难得到阳性菌落，化转效率低，不如电转效率高，电转对感受态细胞影响较大，要求较高，我再摸摸试试。谢谢您
赞一下 回复此楼
就让那流水带走光阴的故事
5楼2013-11-26 10:02:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

guoyanfei

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-27 01:45:40
引用回帖:
5楼: Originally posted by 判官小艾 at 2013-11-26 10:02:56
化转也做了但是很难得到阳性菌落，化转效率低，不如电转效率高，电转对感受态细胞影响较大，要求较高，我再摸摸试试。谢谢您...

你用的是CaCl2法吗?建议你用KCM法，我们建库度是用的KCM法，电转化很容易污染，对感受态细胞杀伤力很大，假阳性率有时候很高，很难排除问题的所在。另外，你可以改变条件连接一下，22度连接6h，4度连接24h，你试试看，只要酶切没问题，连接转化一般不会有问题的。
赞一下 回复此楼
6楼2013-11-26 11:30:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

判官小艾

木虫 (正式写手)

读研有时候需要的是勇气
引用回帖:
6楼: Originally posted by guoyanfei at 2013-11-25 15:30:20
你用的是CaCl2法吗?建议你用KCM法，我们建库度是用的KCM法，电转化很容易污染，对感受态细胞杀伤力很大，假阳性率有时候很高，很难排除问题的所在。另外，你可以改变条件连接一下，22度连接6h，4度连接24h，你试试 ...

我做感受态是这样的。4度收集菌体，用去离子水洗涤菌体，然后用10%的甘油悬浮后离心，最后用1ml的10%的甘油悬浮菌体即可，所有的操作都在冰上进行的
赞一下 回复此楼
就让那流水带走光阴的故事
7楼2013-11-26 21:02:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by guoyanfei at 2013-11-26 11:30:20
你用的是CaCl2法吗?建议你用KCM法，我们建库度是用的KCM法，电转化很容易污染，对感受态细胞杀伤力很大，假阳性率有时候很高，很难排除问题的所在。另外，你可以改变条件连接一下，22度连接6h，4度连接24h，你试试 ...

能够详细说下KCM 法？
赞一下 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
8楼2013-11-27 01:46:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 判官小艾 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[找工作] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 Ocx3OKOzGU4q 2026-08-03 6/300 2026-08-04 11:36 by MWRYsWbJw4DE
[考研] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 Ocx3OKOzGU4q 2026-08-03 6/300 2026-08-04 11:34 by MWRYsWbJw4DE
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 Ocx3OKOzGU4q 2026-08-03 7/350 2026-08-04 11:31 by MWRYsWbJw4DE
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 Ocx3OKOzGU4q 2026-08-03 4/200 2026-08-04 11:26 by MWRYsWbJw4DE
[基金申请] 娱乐 +3 Tide man 2026-08-03 3/150 2026-08-04 09:58 by gltch
[基金申请] 面上提前没消息，有中的吗 +14 archvillain 2026-08-02 17/850 2026-08-04 09:46 by archvillain
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 f1dmPx051StA 2026-08-03 7/350 2026-08-04 09:31 by v1TJC4qJauAB
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 jRl3mE6ddZGq 2026-08-03 10/500 2026-08-04 09:26 by v1TJC4qJauAB
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +5 cu9Nq1xK233Z 2026-08-03 10/500 2026-08-04 09:15 by v1TJC4qJauAB
[有机交流] 一个有机合成实验室都需要哪些设备？ 50+3 kf2781974 2026-07-31 10/500 2026-08-04 08:05 by 88817753
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 cu9Nq1xK233Z 2026-08-03 9/450 2026-08-04 07:37 by k7OM8YghWbkC
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 cu9Nq1xK233Z 2026-08-03 6/300 2026-08-04 06:10 by k7OM8YghWbkC
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 cu9Nq1xK233Z 2026-08-03 7/350 2026-08-04 04:46 by k7OM8YghWbkC
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 cu9Nq1xK233Z 2026-08-03 8/400 2026-08-04 03:21 by k7OM8YghWbkC
[基金申请] 什么时候能放榜呀？ +3 Jacob678 2026-08-03 3/150 2026-08-03 16:14 by gltch
[高分子] UV压敏胶开发 +3 ichall 2026-07-30 5/250 2026-08-03 14:40 by Sunrisepay
[基金申请] 面上再次挂了，太难了，躺也躺不了，倦也卷不过，小学校之殇！ +19 低垂的野花 2026-07-31 25/1250 2026-08-03 09:25 by gy116024
[基金申请] 微信指数没变化，科研之友没阅读 +15 wangze12014 2026-07-28 19/950 2026-08-02 20:05 by 蔡棒棒菂
[考博] 2027年申博 50+3 射雕英雄胜 2026-07-30 3/150 2026-08-02 09:36 by lfy8008
[基金申请] 你们的时间戳变了吗 +3 archvillain 2026-07-30 4/200 2026-07-30 18:53 by levinzhwen
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭