应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接问题求助高手
111/2返回列表12下一页
查看: 1765  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

xiaopeiliang

金虫 (小有名气)

[求助] 连接问题求助高手

最近在做一个连接，载体单酶切后，直接用T4连接酶连接涂板后居然不长，去磷酸化后就更不长了,更不要提连接目的片段的体系了，求解，纠结非常
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-11-05 21:08:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-06 10:17:27
xiaopeiliang: 金币+2, ★有帮助, 载体对照没有问题，其它的也尝试过啦 2013-11-06 22:52:22
第一：做个没有酶切的载体转化感受态做对照；第二：连接酶连其他东西看是不是失效；第三：抗生素有没有搞错；第四：培养条件是否正确；第五：转化条件是否正确。确定了这些问题之后，肯定会找到原因。
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2013-11-06 08:55:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-11-06 08:28:22
xiaopeiliang: 金币+2, ★有帮助, 尝试不同去磷酸化量就是为了不过度去磷酸化，想找个合适的量，能够让载体自连几个，不知道合理不，其它的都尝试过啦，不是原因 2013-11-06 22:51:23
确定T4 ligase是不是失效了。载体单酶切连接发生自连，去磷酸化是为了避免自连，当然不会长了。另外，你的感受态细胞是否好用，是否转了为经酶切的载体质粒作为正对照？
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2013-11-06 07:44:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liutong1026

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-07 22:22:19
xiaopeiliang: 金币+3, ★有帮助, 好的尝试下 2013-11-08 11:15:06
自己的经验，pcr、酶切、连接一天做完，（类似T克隆请注意加A）,可以试下四度连过夜，然后16度半天（5小时吧）这样可能长得不太多但阳性近乎100%，感受态不要反复融
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2013-11-07 21:12:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xiaopeiliang: 金币+1, 这个可以排除了 2013-11-06 22:49:38
请检查一下载体的抗性
赞一下 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-11-06 01:42:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bingdong05

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-06 10:17:39
xiaopeiliang: 金币+2, ★有帮助, 这些都常规的尝试过啦 2013-11-06 22:53:24
感受态木有问题的前提下，首先看下抗性是否正确，加的量是否过多；二，转化时利用空载体做个对照；三，检查载体和目的片段的比例是否合适，一般在1:3到1:10之间。
赞一下 回复此楼
5楼2013-11-06 09:32:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiaopeiliang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-11-06 01:42:58
请检查一下载体的抗性

这个可以排除了。。。
回复此楼
6楼2013-11-06 22:49:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-06 07:44:23
确定T4 ligase是不是失效了。载体单酶切连接发生自连，去磷酸化是为了避免自连，当然不会长了。另外，你的感受态细胞是否好用，是否转了为经酶切的载体质粒作为正对照？

我不明白你的意思。去磷酸化的目的就是完全避免载体自连的。不知道所谓过度是什么意思。自连的载体就是你原来的质粒，这个你要来干什么？
赞一下 回复此楼
7楼2013-11-07 05:55:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-07 15:56:27
感受态细胞效率非常低，甚至死了--比如保存前没加甘油；抗性不对；质粒处理过程被DNA酶降解了。否则，怎么酶切连接处理后转化，至少有几个质粒被转出来。
赞一下 回复此楼
为什么
8楼2013-11-07 08:33:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冷眼倦天涯

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-07 15:56:33
确定T4连接酶没有问题，或者buffer之类的没有问题，如果都没有问题，再连接一次啊试试！！！单酶切应该容易连接才对
赞一下 回复此楼
9楼2013-11-07 15:45:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 xiaopeiliang 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 工科材料085601 279求调剂 +3 困于星晨 2026-03-17 3/150 2026-03-17 14:08 by ms629
[考研] 材料专硕306英一数二 +6 z1z2z3879 2026-03-16 8/400 2026-03-17 14:03 by 勇敢太监王公公
[考博] 26申博 +4 八旬速览 2026-03-16 4/200 2026-03-17 13:00 by 轻松不少随
[考研] 304求调剂 +4 ahbd 2026-03-14 4/200 2026-03-16 16:48 by 我的船我的海
[考研] 085600材料与化工 求调剂 +13 enenenhui 2026-03-13 14/700 2026-03-16 15:19 by 了了了了。。
[考研] 327求调剂 +6 拾光任染 2026-03-15 11/550 2026-03-15 22:47 by 拾光任染
[考研] 288求调剂 +4 奇点0314 2026-03-14 4/200 2026-03-14 23:04 by JourneyLucky
[考研] 材料与化工 323 英一+数二+物化，一志愿：哈工大 本人本科双一流 +4 自由的_飞翔 2026-03-13 5/250 2026-03-14 19:39 by hmn_wj
[考研] 材料与化工（0856）304求B区调剂 +6 邱gl 2026-03-12 7/350 2026-03-13 23:24 by 邱gl
[考研] 一志愿中科院，化学方向，295求调剂 +4 一氧二氮 2026-03-11 4/200 2026-03-13 22:35 by JourneyLucky
[考研] ［0860］321分求调剂，ab区皆可 +4 宝贵热 2026-03-13 4/200 2026-03-13 22:01 by 星空星月
[考研] 0856材料与化工301求调剂 +5 奕束光 2026-03-13 5/250 2026-03-13 22:00 by 星空星月
[考研] （081700）化学工程与技术-298分求调剂 +12 11啦啦啦 2026-03-11 35/1750 2026-03-13 21:25 by JourneyLucky
[考研] 求b区学校调剂 +3 周56 2026-03-11 3/150 2026-03-13 16:20 by JourneyLucky
[考研] 求调剂 +7 18880831720 2026-03-11 7/350 2026-03-13 16:10 by JourneyLucky
[考研] 307求调剂 +5 超级伊昂大王 2026-03-12 5/250 2026-03-13 15:56 by 棒棒球手
[考研] 工科材料085601 279求调剂 +8 困于星晨 2026-03-12 10/500 2026-03-13 15:42 by ms629
[考研] 295求调剂 +3 小匕仔汁 2026-03-12 3/150 2026-03-13 15:17 by vgtyfty
[考研] 296求调剂 +3 大口吃饭 身体健 2026-03-13 3/150 2026-03-13 10:31 by 学员8dgXkO
[考博] 26申博求助 +3 跳跃饼干 2026-03-10 4/200 2026-03-10 21:15 by Tntcnn
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭