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xiaopeiliang

金虫 (小有名气)

[求助] 连接问题求助高手

最近在做一个连接,载体单酶切后,直接用T4连接酶连接涂板后居然不长,去磷酸化后就更不长了,更不要提连接目的片段的体系了,求解,纠结非常
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-11-06 08:28:22
xiaopeiliang: 金币+2, 有帮助, 尝试不同去磷酸化量就是为了不过度去磷酸化,想找个合适的量,能够让载体自连几个,不知道合理不,其它的都尝试过啦,不是原因 2013-11-06 22:51:23
确定T4 ligase是不是失效了。载体单酶切连接发生自连,去磷酸化是为了避免自连,当然不会长了。另外,你的感受态细胞是否好用,是否转了为经酶切的载体质粒作为正对照?
3楼2013-11-06 07:44:23
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-06 07:44:23
确定T4 ligase是不是失效了。载体单酶切连接发生自连,去磷酸化是为了避免自连,当然不会长了。另外,你的感受态细胞是否好用,是否转了为经酶切的载体质粒作为正对照?

我不明白你的意思。去磷酸化的目的就是完全避免载体自连的。不知道所谓过度是什么意思。自连的载体就是你原来的质粒,这个你要来干什么?
7楼2013-11-07 05:55:13
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