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xiaopeiliang

金虫 (小有名气)

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[求助] 连接问题求助高手

最近在做一个连接，载体单酶切后，直接用T4连接酶连接涂板后居然不长，去磷酸化后就更不长了,更不要提连接目的片段的体系了，求解，纠结非常

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1楼 2013-11-05 21:08:04

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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-11-06 08:28:22
xiaopeiliang: 金币+2, ★有帮助, 尝试不同去磷酸化量就是为了不过度去磷酸化，想找个合适的量，能够让载体自连几个，不知道合理不，其它的都尝试过啦，不是原因 2013-11-06 22:51:23

确定T4 ligase是不是失效了。载体单酶切连接发生自连，去磷酸化是为了避免自连，当然不会长了。另外，你的感受态细胞是否好用，是否转了为经酶切的载体质粒作为正对照？

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3楼2013-11-06 07:44:23

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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xiaopeiliang: 金币+1, 这个可以排除了 2013-11-06 22:49:38

请检查一下载体的抗性

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2楼2013-11-06 01:42:58

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wangqi1107

银虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-06 10:17:27
xiaopeiliang: 金币+2, ★有帮助, 载体对照没有问题，其它的也尝试过啦 2013-11-06 22:52:22

第一：做个没有酶切的载体转化感受态做对照；第二：连接酶连其他东西看是不是失效；第三：抗生素有没有搞错；第四：培养条件是否正确；第五：转化条件是否正确。确定了这些问题之后，肯定会找到原因。

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4楼2013-11-06 08:55:15

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bingdong05

银虫 (正式写手)

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专业: 微生物生理与生物化学

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-06 10:17:39
xiaopeiliang: 金币+2, ★有帮助, 这些都常规的尝试过啦 2013-11-06 22:53:24

感受态木有问题的前提下，首先看下抗性是否正确，加的量是否过多；二，转化时利用空载体做个对照；三，检查载体和目的片段的比例是否合适，一般在1:3到1:10之间。

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5楼2013-11-06 09:32:33

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