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定点突变出酶切之后出问题求助！！！急 求高手
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求助啊求助~~~~~~~~~~ 由于开始做实验，老师给我的这个任务是定点突变。实验的大概是这样的： 实验的引物是老师设计的。我们所用的引物基本都是他设计的。 实验目的是用定点突变的方法在目的基因里引入一个柔性片段。 实验采用的试剂盒是takara公司的KOD-Plus-Mutagenesis Kit试剂盒。 pcr的反应是 10XPCR Buffer 5μl plasimd 50ng 2mMdNTPs 5μl 10μM Primer F/R 1.5μl KOD-PlusDNApolymerase 1μl H2O up to 50μl 一般总的体系为50μl，但一般我们都减半做，就是25. pcr反应条件是： 94℃ 2min 98 ℃10sec 68 ℃1min/kb for 6 cycle 4℃ soaking 这些反应条件是试剂盒里所要求的。循环数是以前的师姐摸索出来的最佳循环数。 每次PCR结束后我都取2μl跑了电泳，实验组合对照组的有条带，且在对的位置上（4000多那个位置上）。但是他们的明亮度差不多。 每次都是到酶切的时候出问题。 用1μlDpnI在37度酶切一小时之后跑电泳。按理说酶切之后对照组都没有条带，而实验组的条带应该跟PCR是的差不多才对。 可是电泳条带却都是错的。酶切后的实验组和对照组都有条带，而且都在1000多的地方。 最开始以为是模板量太多了的缘故，但是这几天我把模板稀释了，加进去的量基本上都比标准用量（25ng）少一点。但是结果却还是跟以前一样，只是条带亮度暗些。 我这是出了什么问题啊？？？？？？？？？？？？求指教啊。 |
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2楼2011-04-18 10:51:10
新人小玥
木虫 (正式写手)
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【答案】应助回帖
★ ★ ★
dhd997(金币+3): 鼓励交流 2011-04-18 18:51:48
amisking(EPI+1): 鼓励发帖应助。 2011-04-18 19:16:54
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amisking(EPI+1): 鼓励发帖应助。 2011-04-18 19:16:54
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我想是不是你的Dpn1有点问题呢？如果说亮度较暗，说明可能有部分消化了。 确认一下你的酶吧。目前我只能想到这么多。 我在原来做定点突变的时候很顺利，没什么障碍。不过我的体系和程序跟你的都不一样，所以不好说。 还有我有一个问题，你的模板只有25ng，加入2ul之后，对照组能看到条带吗？我在加入100ng，PCR16cycle之后条带都不是很亮。 没帮上你什么，只是发表我的小想法。 |
3楼2011-04-18 17:17:41
4楼2011-04-18 19:12:17
5楼2011-04-21 20:53:12
6楼2011-04-21 20:54:18
7楼2011-04-21 20:56:06
8楼2011-07-15 15:22:55
匿名
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9楼2012-04-30 16:12:16
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
| 如果你加的模版量真是25ng左右， 25ul的PCR体系， 点2ul跑胶，很难看到条带，总共才2ng，怎么能看到？ 一般能拍出来条带，至少要个10ng左右。 所以你实际加的模版量是大于25ng的，这样的话你实验组跑胶看到的条带实际上就是模版DNA，因为只有6个循环，2的6次方，你不怕麻烦的话可以把模版DNA的mol数计算出来，进而估算出PCR出来的DNA的量，6个循环绝对看不到条带的，做20个都不见得能看到。 我想你们只做6个循环是怕循环数太多会引入突变，我以前用takara的primeSTAR 做点突变，都做30个循环，没什么突变，而且我的载体有6kb。 如果你们仍然坚持只做6个循环的话，建议你不用跑胶了，DpnI 处理过夜之后直接做转化，一般DpnI效率不会很高的，你想一个载体里面少说也有30-40个DpnI位点，这是什么概念？加入你放了25ng模版，一个模版分子上有30个DpnI位点，就是25ngX30=750ng，相当于单酶切位点的情况下方了750ng的DNA，而你的模版肯定是多于25ng的，况且酶在运出和储存的时候已经损失了很多活性了，1个小时肯定不够，我一般都是过夜。 |
10楼2012-04-30 19:55:57