| 查看: 3215 | 回复: 9 | ||
| 本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
定点突变出酶切之后出问题求助！！！急 求高手
|
||
|
求助啊求助~~~~~~~~~~ 由于开始做实验，老师给我的这个任务是定点突变。实验的大概是这样的： 实验的引物是老师设计的。我们所用的引物基本都是他设计的。 实验目的是用定点突变的方法在目的基因里引入一个柔性片段。 实验采用的试剂盒是takara公司的KOD-Plus-Mutagenesis Kit试剂盒。 pcr的反应是 10XPCR Buffer 5μl plasimd 50ng 2mMdNTPs 5μl 10μM Primer F/R 1.5μl KOD-PlusDNApolymerase 1μl H2O up to 50μl 一般总的体系为50μl，但一般我们都减半做，就是25. pcr反应条件是： 94℃ 2min 98 ℃10sec 68 ℃1min/kb for 6 cycle 4℃ soaking 这些反应条件是试剂盒里所要求的。循环数是以前的师姐摸索出来的最佳循环数。 每次PCR结束后我都取2μl跑了电泳，实验组合对照组的有条带，且在对的位置上（4000多那个位置上）。但是他们的明亮度差不多。 每次都是到酶切的时候出问题。 用1μlDpnI在37度酶切一小时之后跑电泳。按理说酶切之后对照组都没有条带，而实验组的条带应该跟PCR是的差不多才对。 可是电泳条带却都是错的。酶切后的实验组和对照组都有条带，而且都在1000多的地方。 最开始以为是模板量太多了的缘故，但是这几天我把模板稀释了，加进去的量基本上都比标准用量（25ng）少一点。但是结果却还是跟以前一样，只是条带亮度暗些。 我这是出了什么问题啊？？？？？？？？？？？？求指教啊。 |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有152人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 酶切问题求助
已经有8人回复
- 【求助】基因克隆T载体酶切问题等
已经有8人回复
- 求助：CpG阻止酶切的问题
已经有6人回复
- 【求助/交流】单酶切酶和DNA的比例，体系大小的问题
已经有14人回复
- 【求助/交流】定点突变酶切之后出问题，请教高手~~~~！！！
已经有13人回复
- 【求助/交流】酶切后浓缩的问题
已经有16人回复
- 【求助/交流】酶切连接后的分子大小问题
已经有12人回复
- 【求助/交流】酶切位点重合了的两个酶的酶切问题
已经有13人回复
- 【求助/交流】关于酶切问题
已经有10人回复
- 【求助/交流】酶切问题
已经有6人回复
- 【求助/交流】酶切电泳问题
已经有12人回复
- 【求助/交流】质粒pPICZA酶切问题
已经有5人回复
- 【求助/交流】酶切问题求助！！！
已经有13人回复
- 【求助/交流】酶切灭活问题
已经有5人回复
匿名
用户注销 (正式写手)
- 应助: 7 (幼儿园)
- 金币: 1699.5
- 红花: 3
- 帖子: 384
- 在线: 78.5小时
- 虫号: 0
- 注册: 2011-03-13
- 性别: GG
- 专业: 膜生物化学与膜生物物理学
9楼2012-04-30 16:12:16
2楼2011-04-18 10:51:10
新人小玥
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 2
- 应助: 17 (小学生)
- 金币: 3203.8
- 散金: 87
- 红花: 8
- 帖子: 451
- 在线: 144.4小时
- 虫号: 704924
- 注册: 2009-02-20
- 专业: 林木遗传育种学
【答案】应助回帖
★ ★ ★
dhd997(金币+3): 鼓励交流 2011-04-18 18:51:48
amisking(EPI+1): 鼓励发帖应助。 2011-04-18 19:16:54
dhd997(金币+3): 鼓励交流 2011-04-18 18:51:48
amisking(EPI+1): 鼓励发帖应助。 2011-04-18 19:16:54
|
我想是不是你的Dpn1有点问题呢？如果说亮度较暗，说明可能有部分消化了。 确认一下你的酶吧。目前我只能想到这么多。 我在原来做定点突变的时候很顺利，没什么障碍。不过我的体系和程序跟你的都不一样，所以不好说。 还有我有一个问题，你的模板只有25ng，加入2ul之后，对照组能看到条带吗？我在加入100ng，PCR16cycle之后条带都不是很亮。 没帮上你什么，只是发表我的小想法。 |
3楼2011-04-18 17:17:41
4楼2011-04-18 19:12:17
投票:
