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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】酶切后浓缩的问题
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pidou213

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】酶切后浓缩的问题

酶切完成以后，要电转，但是有两个问题：
1、酶切后，DNA浓度太低
2、若浓缩，因为有BSA参与了酶切反应，用真空浓缩后，甘油浓度很高，影响电转，甚至击穿电转杯。

不知道大家是怎么做的?在尽可能少的减少目的DNA损失的情况下。
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1楼 2010-11-27 00:15:40
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wangy0908

金虫 (正式写手)
★
silicare(金币+1):这个可以考虑的 2010-11-27 08:20:11
那你就用醋酸钠和无水乙醇再抽提一次的，相当于DNA纯化。这样在加适当的水或者其他溶解，浓度就可以了的
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2楼2010-11-27 00:32:28
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2010-11-27 00:32:28:
那你就用醋酸钠和无水乙醇再抽提一次的，相当于DNA纯化。这样在加适当的水或者其他溶解，浓度就可以了的

这样的回收率能达到多少呢？
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3楼2010-11-27 01:18:33
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
pidou213(金币+1):可否指点一二，哪里有卖的? 2010-11-29 16:03:29
有卖那种很便宜的核酸共沉剂，加了一些东西当DNA沉淀指示的，回收率高很多
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4楼2010-11-27 09:15:19
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)
pidou213(金币+2):谢谢 2010-11-27 17:03:27
pidou213(金币+1):谢谢啊 2010-11-29 16:03:46
加核酸共沉淀剂如glycogen共沉淀，用乙醇醋酸钠方法沉淀，分子克隆上有，一般达到70%左右回收率
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5楼2010-11-27 09:50:50
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piaopiao233

金虫 (小有名气)
直接试剂盒纯化一下在浓缩呢？
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6楼2010-11-27 09:59:28
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jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)
★ ★
dhd997(金币+2):谢谢交流 2010-11-27 11:03:41
pidou213(金币+2):Thanks for your answer 2010-11-27 17:02:41
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2010-11-27 00:32:28:
那你就用醋酸钠和无水乙醇再抽提一次的，相当于DNA纯化。这样在加适当的水或者其他溶解，浓度就可以了的

对的
我们酶切后要是DNA浓度太低的话
就常用这种方法
在分子克隆实验指南上面有这种方法
回收率做的好的话是能上80-85%的
只有在管壁上贴附一部分造成DNA损失
至于要求终浓度是多少就在于你最后加多少的水回融了
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7楼2010-11-27 10:59:04
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2010-11-27 00:15:40:
酶切完成以后，要电转，但是有两个问题：
1、酶切后，DNA浓度太低
2、若浓缩，因为有BSA参与了酶切反应，用真空浓缩后，甘油浓度很高，影响电转，甚至击穿电转杯。

不知道大家是怎么做的?在尽可能少的减少目 ...

咋个会有酶切后直接电转的来？
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8楼2010-11-27 16:08:07
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by piaopiao233 at 2010-11-27 09:59:28:
直接试剂盒纯化一下在浓缩呢？

可否推荐一款呢？
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9楼2010-11-27 17:03:05
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piaopiao233

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2010-11-27 17:03:05:



可否推荐一款呢？

这些很多的，你看看你们实验室一般用什么牌子的。

国内的一般用碧云天的
不过国外的相对质量要好一点
一般纯化试剂盒不会有什么太大问题的
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10楼2010-11-27 17:43:06
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xiezhenrong

金虫 (正式写手)
先酚仿抽提一次，再用无水乙醇加醋酸钠沉淀
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11楼2010-11-27 22:55:42
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wmj840613

木虫 (小有名气)
回收时多一步收集产物，不过电转化的效率很高，个人觉得不必要在意，做过很多次还没有见过转化失败的。。
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12楼2010-11-28 10:45:24
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wmqouc

金虫 (著名写手)
pidou213(金币+2):是线性化的，你的意思是，不需要加氯仿那一步吗？那BSA等怎没去出呢？ 2010-11-29 16:07:23
你怎么直接把酶切产物直接电转到菌里吗？
线性的DNA产物吗？
奇怪啊。

可以加入无水乙醇过夜沉淀，第二天离心去掉上清，再加入水或你用的buffer溶解，就达到浓缩目的了
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13楼2010-11-28 19:20:04
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by piaopiao233 at 2010-11-27 09:59:28:
直接试剂盒纯化一下在浓缩呢？

损失好大啊
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14楼2010-11-29 16:04:04
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by wmqouc at 2010-11-28 19:20:04:
你怎么直接把酶切产物直接电转到菌里吗？
线性的DNA产物吗？
奇怪啊。

可以加入无水乙醇过夜沉淀，第二天离心去掉上清，再加入水或你用的buffer溶解，就达到浓缩目的了

好的啊，谢谢啊
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15楼2010-11-29 16:05:41
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by wmqouc at 2010-11-28 19:20:04:
你怎么直接把酶切产物直接电转到菌里吗？
线性的DNA产物吗？
奇怪啊。

可以加入无水乙醇过夜沉淀，第二天离心去掉上清，再加入水或你用的buffer溶解，就达到浓缩目的了

是线性化的，你的意思是，不需要加氯仿那一步吗？那BSA等怎没去出呢？
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16楼2010-11-29 16:07:36
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zhaohq120917楼
2010-11-29 18:58   回复  
pidou213(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by xiezhenrong at 2010-11-27 22:55:42: 先酚仿抽提一次，再用无水乙醇加醋酸钠沉淀

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