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maggiell

新虫 (初入文坛)

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[求助] 定点突变出酶切之后出问题求助！！！急求高手

求助啊求助~~~~~~~~~~

由于开始做实验，老师给我的这个任务是定点突变。实验的大概是这样的：

实验的引物是老师设计的。我们所用的引物基本都是他设计的。

实验目的是用定点突变的方法在目的基因里引入一个柔性片段。

实验采用的试剂盒是takara公司的KOD-Plus-Mutagenesis Kit试剂盒。

pcr的反应是

10XPCR Buffer                5μl

plasimd                         50ng

2mMdNTPs                      5μl

10μM Primer F/R          1.5μl

KOD-PlusDNApolymerase  1μl

H2O                               up to 50μl

一般总的体系为50μl，但一般我们都减半做，就是25.

pcr反应条件是：

94℃ 2min

98 ℃10sec

68 ℃1min/kb for 6 cycle

4℃ soaking

这些反应条件是试剂盒里所要求的。循环数是以前的师姐摸索出来的最佳循环数。

每次PCR结束后我都取2μl跑了电泳，实验组合对照组的有条带，且在对的位置上（4000多那个位置上）。但是他们的明亮度差不多。

每次都是到酶切的时候出问题。

用1μlDpnI在37度酶切一小时之后跑电泳。按理说酶切之后对照组都没有条带，而实验组的条带应该跟PCR是的差不多才对。

可是电泳条带却都是错的。酶切后的实验组和对照组都有条带，而且都在1000多的地方。

最开始以为是模板量太多了的缘故，但是这几天我把模板稀释了，加进去的量基本上都比标准用量（25ng）少一点。但是结果却还是跟以前一样，只是条带亮度暗些。

我这是出了什么问题啊？？？？？？？？？？？？求指教啊。

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