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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接产物电泳
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更深的蓝

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】连接产物电泳


如图，由于孔道有限，没点P双酶切后PCR产物的样，连接产物最下面的一条带就是PCR产物的条带。不知道算不算连接上了。

[ Last edited by 更深的蓝 on 2010-10-28 at 10:30 ]
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低调务实！
1楼 2010-10-28 10:28:59
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hyw1989960

木虫 (正式写手)

快乐家族二十八
更深的蓝(金币+1): 2010-10-31 14:32:07
看不懂你的图，一般验证方法是将连接产物转化大肠杆菌，挑阳性克隆，再提质粒做PCR验证和酶切验证
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快乐家族
2楼2010-10-29 22:03:31
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jackiechubut

木虫 (小有名气)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-10-30 11:02:32
更深的蓝(金币+1): 2010-10-31 14:32:12
连接产物一般无法直接这样电泳判断的，毕竟有连接上的，有未连接上的，到分子级别，一般电泳是无法检测的。还是转入大肠杆菌中检测筛选出克隆比较好
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一笑寂寥空万古，三分明月照大江
3楼2010-10-29 23:50:20
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路人甲007

木虫 (正式写手)

小七
★
dhd997(金币+1):很活跃，鼓励。 2010-10-30 11:02:41
更深的蓝(金币+1): 2010-10-31 14:32:15
跑胶一般不好确定
要想真正的确定的话 转化挑克隆 菌落PCR  测序
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与人玫瑰手有余香
4楼2010-10-30 09:44:26
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602059625

金虫 (知名作家)
分析化学也做这个？
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[url=http://ip.WoTuLa.com][img]http://i.WoTuLa.com/note.png?name=填写姓名&say=这里填写您想说的内容。[/img][/url]
5楼2010-10-30 12:38:32
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更深的蓝

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by jackiechubut at 2010-10-29 23:50:20:
连接产物一般无法直接这样电泳判断的，毕竟有连接上的，有未连接上的，到分子级别，一般电泳是无法检测的。还是转入大肠杆菌中检测筛选出克隆比较好

转了，长出的克隆都没质粒，才跑胶的。
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低调务实！
6楼2010-10-31 14:32:59
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更深的蓝

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 602059625 at 2010-10-30 12:38:32:
分析化学也做这个？

化学和生物不分家啊，呵呵
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低调务实！
7楼2010-10-31 14:33:28
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fzfangtao

木虫 (正式写手)
看不懂，一般先做个菌液PCR，看看有没有
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8楼2010-10-31 15:51:02
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jackiechubut

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 更深的蓝 at 2010-10-31 14:32:59:

转了，长出的克隆都没质粒，才跑胶的。

那你只有从连接之前的步骤开始做了，从新酶切片段和质粒进行连接，条件的优化。如果连接的转化之后挑选克隆进行酶切没有结果的话，就算你进行PCR鉴定也没什么用处的—这种PCR检测具有很高的假阳性。建议你从新开始，考虑连接的量还有条件的优化，插入片段回收问题，避免浪费更多的时间。
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一笑寂寥空万古，三分明月照大江
9楼2010-10-31 16:50:26
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sifantong

新虫 (初入文坛)
★
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-11-01 11:58:02
第一确定你的PCR产物 回收的效率  确定片段量是足够的
第二确定连接体系 一般片段和载体的分子数比例是3：1
第三你说提质粒提不出来也有可能是感受态的问题  我遇到过 换了感受态就好了
第四连接产物跑电泳鉴定这个方法是没用的，基本不会用这个方法的 呵呵
好好试试吧  个人建议
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10楼2010-11-01 11:29:22
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