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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接产物电泳
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liyong1981

金虫 (正式写手)
你这个图，说实话，在下看着真费劲，标注没做高，~我保持沉默，再有，有没有连接上，酶切是罪好的检验，PCR次之，多玩玩VNTI好了~
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11楼2010-11-01 11:45:50
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silicare

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优秀版主
更深的蓝(金币+2): 2010-11-02 08:47:45
连接成功与否是不能用电泳检测的，前面虫友已经说的很清楚了，只有通过克隆

没长菌不见得就是没有连接上，可能你的感受态效率太低了
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12楼2010-11-01 11:59:35
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更深的蓝

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by silicare at 2010-11-01 11:59:35:
连接成功与否是不能用电泳检测的，前面虫友已经说的很清楚了，只有通过克隆

没长菌不见得就是没有连接上，可能你的感受态效率太低了

现在怀疑PCR产物有一端没有酶切完全
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低调务实！
13楼2010-11-02 08:48:45
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主问题解决了吗？我的是连接出来后转化出了斑，挑斑和摇菌菌液都能得到目的基因的扩增带。但是提取的质粒PCR结果无目的基因带，酶切后条带也不理想。重复了两次还是一样，不知原因？
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14楼2013-06-08 16:30:57
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by liyong1981 at 2010-11-01 11:45:50
你这个图，说实话，在下看着真费劲，标注没做高，~我保持沉默，再有，有没有连接上，酶切是罪好的检验，PCR次之，多玩玩VNTI好了~

我的是连接出来后转化出了斑，挑斑和摇菌菌液都能得到目的基因的扩增带。但是提取的质粒PCR结果无目的基因带，酶切后条带也不理想。重复了两次还是一样，不知原因？
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15楼2013-06-08 16:31:28
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hyw1989960 at 2010-10-29 22:03:31
看不懂你的图，一般验证方法是将连接产物转化大肠杆菌，挑阳性克隆，再提质粒做PCR验证和酶切验证

我的是连接出来后转化出了斑，挑斑和摇菌菌液都能得到目的基因的扩增带。但是提取的质粒PCR结果无目的基因带，酶切后条带也不理想。重复了两次还是一样，不知原因？
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16楼2013-06-08 16:32:03
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jackiechubut at 2010-10-29 23:50:20
连接产物一般无法直接这样电泳判断的，毕竟有连接上的，有未连接上的，到分子级别，一般电泳是无法检测的。还是转入大肠杆菌中检测筛选出克隆比较好

我的是连接出来后转化出了斑，挑斑和摇菌菌液都能得到目的基因的扩增带。但是提取的质粒PCR结果无目的基因带，酶切后条带也不理想。重复了两次还是一样，不知原因？
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17楼2013-06-08 16:32:13
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by sifantong at 2010-11-01 11:29:22
第一确定你的PCR产物 回收的效率  确定片段量是足够的
第二确定连接体系 一般片段和载体的分子数比例是3：1
第三你说提质粒提不出来也有可能是感受态的问题  我遇到过 换了感受态就好了
第四连接产物跑电泳鉴定这 ...

我的是连接出来后转化出了斑，挑斑和摇菌菌液都能得到目的基因的扩增带。但是提取的质粒PCR结果无目的基因带，酶切后条带也不理想。重复了两次还是一样，不知原因？
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18楼2013-06-08 16:32:27
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