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更深的蓝

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】连接产物电泳


如图,由于孔道有限,没点P双酶切后PCR产物的样,连接产物最下面的一条带就是PCR产物的条带。不知道算不算连接上了。

[ Last edited by 更深的蓝 on 2010-10-28 at 10:30 ]
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低调务实!
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hyw1989960

木虫 (正式写手)

快乐家族二十八

更深的蓝(金币+1): 2010-10-31 14:32:07
看不懂你的图,一般验证方法是将连接产物转化大肠杆菌,挑阳性克隆,再提质粒做PCR验证和酶切验证
快乐家族
2楼2010-10-29 22:03:31
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jackiechubut

木虫 (小有名气)


dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-10-30 11:02:32
更深的蓝(金币+1): 2010-10-31 14:32:12
连接产物一般无法直接这样电泳判断的,毕竟有连接上的,有未连接上的,到分子级别,一般电泳是无法检测的。还是转入大肠杆菌中检测筛选出克隆比较好
一笑寂寥空万古,三分明月照大江
3楼2010-10-29 23:50:20
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路人甲007

木虫 (正式写手)

小七


dhd997(金币+1):很活跃,鼓励。 2010-10-30 11:02:41
更深的蓝(金币+1): 2010-10-31 14:32:15
跑胶一般不好确定
要想真正的确定的话 转化挑克隆 菌落PCR  测序
与人玫瑰手有余香
4楼2010-10-30 09:44:26
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602059625

金虫 (知名作家)

分析化学也做这个?
[url=http://ip.WoTuLa.com][img]http://i.WoTuLa.com/note.png?name=填写姓名&say=这里填写您想说的内容。[/img][/url]
5楼2010-10-30 12:38:32
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更深的蓝

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by jackiechubut at 2010-10-29 23:50:20:
连接产物一般无法直接这样电泳判断的,毕竟有连接上的,有未连接上的,到分子级别,一般电泳是无法检测的。还是转入大肠杆菌中检测筛选出克隆比较好

转了,长出的克隆都没质粒,才跑胶的。
低调务实!
6楼2010-10-31 14:32:59
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更深的蓝

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by 602059625 at 2010-10-30 12:38:32:
分析化学也做这个?

化学和生物不分家啊,呵呵
低调务实!
7楼2010-10-31 14:33:28
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fzfangtao

木虫 (正式写手)

看不懂,一般先做个菌液PCR,看看有没有
8楼2010-10-31 15:51:02
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jackiechubut

木虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 更深的蓝 at 2010-10-31 14:32:59:

转了,长出的克隆都没质粒,才跑胶的。

那你只有从连接之前的步骤开始做了,从新酶切片段和质粒进行连接,条件的优化。如果连接的转化之后挑选克隆进行酶切没有结果的话,就算你进行PCR鉴定也没什么用处的—这种PCR检测具有很高的假阳性。建议你从新开始,考虑连接的量还有条件的优化,插入片段回收问题,避免浪费更多的时间。
一笑寂寥空万古,三分明月照大江
9楼2010-10-31 16:50:26
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sifantong

新虫 (初入文坛)


silicare(金币+1):谢谢参与 2010-11-01 11:58:02
第一确定你的PCR产物 回收的效率  确定片段量是足够的
第二确定连接体系 一般片段和载体的分子数比例是3:1
第三你说提质粒提不出来也有可能是感受态的问题  我遇到过 换了感受态就好了
第四连接产物跑电泳鉴定这个方法是没用的,基本不会用这个方法的 呵呵
好好试试吧  个人建议
10楼2010-11-01 11:29:22
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