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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蓝白斑筛选只长白斑
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早冰124

新虫 (初入文坛)

[求助] 蓝白斑筛选只长白斑

蓝白斑筛选，pUC19检测感受态细胞是转化效率很高，蓝白斑筛选后均为蓝斑，但为何连接产物转化后全是白斑，一个蓝斑都没有，并且菌落PCR检测所有的白色菌落均批不出目的条带，这是什么原因，更奇怪的是BL21做感受态细胞时只出现蓝斑，TOP10做感受态细胞时全是白斑，求解，非常感谢啊！
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1楼2012-05-19 21:40:37
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早冰124

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by shenlin0514 at 2012-05-22 10:13:26
建议看看原料是否有问题，例如IPTG和X-gal

这两个没有问题，因为有做对照，pUC19转化Top10全为蓝色菌落
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10楼2012-05-25 12:42:14
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damaomao

禁虫 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
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2楼2012-05-20 10:37:49
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xmuring

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-20 18:41:45
早冰124: 金币+1, ★有帮助 2012-05-21 14:51:18
BL21的lacZ基因在基因组上，在IPTG/Xgal平板上本身就是形成蓝色菌落，而TOP10则是通过质粒和基因组的lac基因片段之间α互补才会产生蓝斑。会不会是克隆没做好，连接失败了？lz是否重复过克隆过程？还有就是抗生素会不会有问题。。。另外，菌落PCR用的引物是M13通用引物还是自己设计的？建议lz说的详细点~~~~一不小心就写了这么多，lz多包涵下
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3楼2012-05-20 17:01:20
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早冰124

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by damaomao at 2012-05-20 10:37:49:
我建议重新要宿主菌  有可能宿主菌出问题了

BL21和Top10都是新买来的，经pUC19转化检测发现转化效率很好，怒视菌的问题
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4楼2012-05-21 14:35:49
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早冰124

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xmuring at 2012-05-20 17:01:20:
BL21的lacZ基因在基因组上，在IPTG/Xgal平板上本身就是形成蓝色菌落，而TOP10则是通过质粒和基因组的lac基因片段之间α互补才会产生蓝斑。会不会是克隆没做好，连接失败了？lz是否重复过克隆过程？还有就是抗生素会

连接转化次数已经做了10次了，起初发现是菌体的问题，后来菌体全换新的了，我用的载体是pGEX-4T1,大约5Kb，经BamHI和SalI双酶切处理，目的片段3Kb，重组质粒大约8Kb,转化BL21（DE3）发现只长蓝斑且菌体较少，转化top10后全为白斑，菌体较多些。但是无论是白斑和蓝斑均做过colony PCR，没有批出目的条带，同时挑选部分菌落培养提取质粒，最终发现质粒在5~6Kb之间，但是连接转化之前有做过l连接产物电泳检测，发现有时在7、8或10Kb之间都出现过条带，但是菌却长得很奇怪，如果说是氨苄问题那也不能解释这个原因啊
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5楼2012-05-21 14:49:12
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早冰124

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xmuring at 2012-05-20 17:01:20:
BL21的lacZ基因在基因组上，在IPTG/Xgal平板上本身就是形成蓝色菌落，而TOP10则是通过质粒和基因组的lac基因片段之间α互补才会产生蓝斑。会不会是克隆没做好，连接失败了？lz是否重复过克隆过程？还有就是抗生素会

引物用的是插入的目的片段的引物
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6楼2012-05-21 14:50:59
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xmuring

木虫 (著名写手)
从lz描述的情况分析应该是克隆米有做成，我的建议是，能否调整下vector和insert DNA的相对摩尔数，重新做克隆。话说你的目的基因好大啊，我也没做过那么大的。。。
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7楼2012-05-21 15:04:32
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早冰124

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xmuring at 2012-05-21 15:04:32:
从lz描述的情况分析应该是克隆米有做成，我的建议是，能否调整下vector和insert DNA的相对摩尔数，重新做克隆。话说你的目的基因好大啊，我也没做过那么大的。。。

按说明书的要求，纳克比在1：1~5：1，我的插入片段比载体为4：1, 8Kb 其实不算太大
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8楼2012-05-21 16:21:27
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shenlin0514

木虫 (正式写手)

无名小虫
建议看看原料是否有问题，例如IPTG和X-gal
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Never say never
9楼2012-05-22 10:13:26
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