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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蓝白斑筛选出现的问题
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jiajunhui

至尊木虫 (著名写手)

[求助] 蓝白斑筛选出现的问题

大家好，我在做蓝白斑筛选的时候使用宝生物的PMD18-T载体，我在做阴性对照的使用灭过菌的双蒸水代替PCR产物与载体连接，可是在平板上长出来的菌都是白斑，我不能理解为什么阴性对照长出来的不是蓝斑都是白斑？
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努力，不抱怨
1楼 2011-04-21 18:57:49
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): 不错 2011-04-22 09:18:17
jiajunhui(金币+1): 2011-04-22 09:36:26
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-04-21 22:54:24:
1：板子上长出来的全部是白斑不是蓝斑说明连接没什么问题啊，你的目的基因插入到了LacZ上面，当然了你可以进行酶切或者PCR验证滴。。。
2：至于你说你阴性对照的板子上全部是白斑，这个阴性对照的板子上面应该都 ...

楼主那种阴性对照的做法，可以检测载体自连的比例有多高，我们一般像楼主那样做呢。
个人觉得X-gal、IPTG有问题的可能性比较大，呵呵~
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5楼2011-04-21 23:09:09
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普通回帖

shandongfmmu

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖应助。 2011-04-21 21:16:38

你好！
蓝白筛选，是再涂有IPTG和X-GAL的筛选平板上，重组菌株为白色，未转入重组质粒的是蓝色。所以我猜想既然阴对也是白色，应该是转入质粒了，有可能是载体切割的问题~比如载体没切开，或者是单酶切了~
     祝您成功！
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快乐~~~~~~~
2楼2011-04-21 19:53:26
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roomofxw

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖应助。 2011-04-21 21:16:44
jiajunhui(金币+1): 2011-04-22 09:34:52
jiajunhui(金币+1): 2011-04-22 09:37:00
若是基本不长蓝斑，那请确认IPTG，和X-gal是否有效，使用方法是否正确。

排除T载体有问题，或者操作有问题，可能性不大
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3楼2011-04-21 20:05:04
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): 继续努力啊 2011-04-22 09:09:06
1：板子上长出来的全部是白斑不是蓝斑说明连接没什么问题啊，你的目的基因插入到了LacZ上面，当然了你可以进行酶切或者PCR验证滴。。。
2：至于你说你阴性对照的板子上全部是白斑，这个阴性对照的板子上面应该都是蓝斑的，不知道你这个阴性对照是怎么做的？

我认为对照应该是这样：重组载体转化进大肠，然后涂布；阴性对照是空质粒转大肠，涂布。。。。

不知道楼主是如何选对照的？还有你的X-gal是否有问题呢？
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2011-04-21 22:54:24
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jiajunhui

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-04-21 22:54:24:
1：板子上长出来的全部是白斑不是蓝斑说明连接没什么问题啊，你的目的基因插入到了LacZ上面，当然了你可以进行酶切或者PCR验证滴。。。
2：至于你说你阴性对照的板子上全部是白斑，这个阴性对照的板子上面应该都 ...

你好，我现在做的是PCR产物与pMD18-T载体连接，阴性对照就是用灭过菌双蒸水代替PCR产物，结果无蓝斑产生，还有我理解你做阴性对照的意思，可是我现在出现的问题和你说的不一样！
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努力，不抱怨
6楼2011-04-22 09:34:22
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jiajunhui

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by shandongfmmu at 2011-04-21 19:53:26:

你好！
蓝白筛选，是再涂有IPTG和X-GAL的筛选平板上，重组菌株为白色，未转入重组质粒的是蓝色。所以我猜想既然阴对也是白色，应该是转入质粒了，有可能是载体切割的问题~比如载体没切开，或者是单酶切了~ ...

你好，我使用的T载体，不是空质粒，不是用载体与目的片段连接！
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努力，不抱怨
7楼2011-04-22 09:40:48
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 鼓励应助 2011-04-22 16:41:37
引用回帖:
Originally posted by jiajunhui at 2011-04-22 09:34:22:
你好，我现在做的是PCR产物与pMD18-T载体连接，阴性对照就是用灭过菌双蒸水代替PCR产物，结果无蓝斑产生，还有我理解你做阴性对照的意思，可是我现在出现的问题和你说的不一样！

你那个平板有抗性的没？你后面转化就是把T载体转入大肠吗？
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在等待中涅槃重生
8楼2011-04-22 10:05:16
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jiajunhui

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by yuxia82012 at 2011-04-22 10:05:16:
你那个平板有抗性的没？你后面转化就是把T载体转入大肠吗？

恩，有抗性的啊，是氨苄青霉素，对，后面转入大肠
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努力，不抱怨
9楼2011-04-22 16:39:16
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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)
我的蓝白斑筛选出现同样问题，隐性克隆也是白色的……
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难免埋怨时间的手，把相爱写成相爱过
10楼2011-05-03 13:51:42
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