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jiajunhui

至尊木虫 (著名写手)

[求助] 蓝白斑筛选出现的问题

大家好,我在做蓝白斑筛选的时候使用宝生物的PMD18-T载体,我在做阴性对照的使用灭过菌的双蒸水代替PCR产物与载体连接,可是在平板上长出来的菌都是白斑,我不能理解为什么阴性对照长出来的不是蓝斑都是白斑?
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努力,不抱怨
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): 不错 2011-04-22 09:18:17
jiajunhui(金币+1): 2011-04-22 09:36:26
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-04-21 22:54:24:
1:板子上长出来的全部是白斑不是蓝斑说明连接没什么问题啊,你的目的基因插入到了LacZ上面,当然了你可以进行酶切或者PCR验证滴。。。
2:至于你说你阴性对照的板子上全部是白斑,这个阴性对照的板子上面应该都 ...

楼主那种阴性对照的做法,可以检测载体自连的比例有多高,我们一般像楼主那样做呢。
个人觉得X-gal、IPTG有问题的可能性比较大,呵呵~
5楼2011-04-21 23:09:09
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普通回帖

shandongfmmu

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖应助。 2011-04-21 21:16:38

你好!
蓝白筛选,是再涂有IPTG和X-GAL的筛选平板上,重组菌株为白色,未转入重组质粒的是蓝色。所以我猜想既然阴对也是白色,应该是转入质粒了,有可能是载体切割的问题~比如载体没切开,或者是单酶切了~
     祝您成功!
快乐~~~~~~~
2楼2011-04-21 19:53:26
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roomofxw

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖应助。 2011-04-21 21:16:44
jiajunhui(金币+1): 2011-04-22 09:34:52
jiajunhui(金币+1): 2011-04-22 09:37:00
若是基本不长蓝斑,那请确认IPTG,和X-gal是否有效,使用方法是否正确。

排除T载体有问题,或者操作有问题,可能性不大
3楼2011-04-21 20:05:04
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): 继续努力啊 2011-04-22 09:09:06
1:板子上长出来的全部是白斑不是蓝斑说明连接没什么问题啊,你的目的基因插入到了LacZ上面,当然了你可以进行酶切或者PCR验证滴。。。
2:至于你说你阴性对照的板子上全部是白斑,这个阴性对照的板子上面应该都是蓝斑的,不知道你这个阴性对照是怎么做的?

我认为对照应该是这样:重组载体转化进大肠,然后涂布;阴性对照是空质粒转大肠,涂布。。。。

不知道楼主是如何选对照的?还有你的X-gal是否有问题呢?
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2011-04-21 22:54:24
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jiajunhui

至尊木虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-04-21 22:54:24:
1:板子上长出来的全部是白斑不是蓝斑说明连接没什么问题啊,你的目的基因插入到了LacZ上面,当然了你可以进行酶切或者PCR验证滴。。。
2:至于你说你阴性对照的板子上全部是白斑,这个阴性对照的板子上面应该都 ...

你好,我现在做的是PCR产物与pMD18-T载体连接,阴性对照就是用灭过菌双蒸水代替PCR产物,结果无蓝斑产生,还有我理解你做阴性对照的意思,可是我现在出现的问题和你说的不一样!
努力,不抱怨
6楼2011-04-22 09:34:22
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jiajunhui

至尊木虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by shandongfmmu at 2011-04-21 19:53:26:

你好!
蓝白筛选,是再涂有IPTG和X-GAL的筛选平板上,重组菌株为白色,未转入重组质粒的是蓝色。所以我猜想既然阴对也是白色,应该是转入质粒了,有可能是载体切割的问题~比如载体没切开,或者是单酶切了~ ...

你好,我使用的T载体,不是空质粒,不是用载体与目的片段连接!
努力,不抱怨
7楼2011-04-22 09:40:48
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


西瓜(金币+1): 鼓励应助 2011-04-22 16:41:37
引用回帖:
Originally posted by jiajunhui at 2011-04-22 09:34:22:
你好,我现在做的是PCR产物与pMD18-T载体连接,阴性对照就是用灭过菌双蒸水代替PCR产物,结果无蓝斑产生,还有我理解你做阴性对照的意思,可是我现在出现的问题和你说的不一样!

你那个平板有抗性的没?你后面转化就是把T载体转入大肠吗?
在等待中涅槃重生
8楼2011-04-22 10:05:16
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jiajunhui

至尊木虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by yuxia82012 at 2011-04-22 10:05:16:
你那个平板有抗性的没?你后面转化就是把T载体转入大肠吗?

恩,有抗性的啊,是氨苄青霉素,对,后面转入大肠
努力,不抱怨
9楼2011-04-22 16:39:16
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yoyoyoyo3985

金虫 (小有名气)

我的蓝白斑筛选出现同样问题,隐性克隆也是白色的……
难免埋怨时间的手,把相爱写成相爱过
10楼2011-05-03 13:51:42
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