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早冰124

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[求助] 蓝白斑筛选只长白斑

蓝白斑筛选，pUC19检测感受态细胞是转化效率很高，蓝白斑筛选后均为蓝斑，但为何连接产物转化后全是白斑，一个蓝斑都没有，并且菌落PCR检测所有的白色菌落均批不出目的条带，这是什么原因，更奇怪的是BL21做感受态细胞时只出现蓝斑，TOP10做感受态细胞时全是白斑，求解，非常感谢啊！

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1楼 2012-05-19 21:40:37

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早冰124

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2楼: Originally posted by damaomao at 2012-05-20 10:37:49:
我建议重新要宿主菌有可能宿主菌出问题了

BL21和Top10都是新买来的，经pUC19转化检测发现转化效率很好，怒视菌的问题

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4楼2012-05-21 14:35:49

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3楼: Originally posted by xmuring at 2012-05-20 17:01:20:
BL21的lacZ基因在基因组上，在IPTG/Xgal平板上本身就是形成蓝色菌落，而TOP10则是通过质粒和基因组的lac基因片段之间α互补才会产生蓝斑。会不会是克隆没做好，连接失败了？lz是否重复过克隆过程？还有就是抗生素会

连接转化次数已经做了10次了，起初发现是菌体的问题，后来菌体全换新的了，我用的载体是pGEX-4T1,大约5Kb，经BamHI和SalI双酶切处理，目的片段3Kb，重组质粒大约8Kb,转化BL21（DE3）发现只长蓝斑且菌体较少，转化top10后全为白斑，菌体较多些。但是无论是白斑和蓝斑均做过colony PCR，没有批出目的条带，同时挑选部分菌落培养提取质粒，最终发现质粒在5~6Kb之间，但是连接转化之前有做过l连接产物电泳检测，发现有时在7、8或10Kb之间都出现过条带，但是菌却长得很奇怪，如果说是氨苄问题那也不能解释这个原因啊

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5楼2012-05-21 14:49:12

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