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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » X—Gal IPTG蓝白斑试验
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南海所老龚

新虫 (正式写手)

[求助] X—Gal IPTG蓝白斑试验

各位大侠好，做克隆时，涂菌前在平板上涂X—Gal 和IPTG，长出来的菌落呈白色和蓝色。我的理解是白色是含有目的片段的菌落，蓝色是不含目的片段但具有抗药基因的菌落，不含抗药基因的菌落则无法生存。但我查阅一些资料之后又发现蓝色菌落可能为假阳性，我是新手，不太明白。请各位多多指教！
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1楼 2011-04-19 23:07:44
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yabxxh

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
reasonspare(金币+2): 谢谢分享 2011-04-20 11:25:48
reasonspare(金币+1): 搂主还有问题，你再麻烦以下。 2011-04-20 11:26:39
南海所老龚(金币+1): 2011-04-26 09:21:49
1.蓝白斑筛选的原理我就不说了，你去查下资料
2.转化了空载体的就是你看到的蓝斑，其抗性来源于空载体；转了重组质粒的就是你看到的白斑，也就是我们的目的菌落。
3.菌落本身是没有抗药基因的，抗生素的筛选依据是根据载体来的。
4.蓝色菌落是转化了空载体的菌落，并不是我们的目的菌落，也就无所谓阳性和假阳性。倒是白斑，我们的目的菌落才是阳性，如果是白斑，但并不是我们需要的目的菌落，才称之为假阳性。
你这几个问题问的很好，说明你好好思考了。刚开始的时候我也是比较困惑这些。
希望以上能帮到你，好运。
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2楼2011-04-20 09:26:17
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南海所老龚

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2011-04-20 09:26:17:
1.蓝白斑筛选的原理我就不说了，你去查下资料
2.转化了空载体的就是你看到的蓝斑，其抗性来源于空载体；转了重组质粒的就是你看到的白斑，也就是我们的目的菌落。
3.菌落本身是没有抗药基因的，抗生素的筛选依据 ...

你好，谢谢你细心的解答。
看完你的解疑之后，我又发现一个新问题：假阳性白斑是怎么生成的？是做连接的时候，载体不是与目的片段连接或者只连接了目的片段的一部分？还有是不是载体自连？我对载体自连不是很懂，希望能从阁下手中受教
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3楼2011-04-20 10:23:58
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫

【答案】应助回帖

★ ★
reasonspare(金币+2): 谢谢分享 2011-04-21 11:28:58
引用回帖:
Originally posted by 南海所老龚 at 2011-04-20 10:23:58:
你好，谢谢你细心的解答。
看完你的解疑之后，我又发现一个新问题：假阳性白斑是怎么生成的？是做连接的时候，载体不是与目的片段连接或者只连接了目的片段的一部分？还有是不是载体自连？我对载体自连不是很 ...

假阳性白斑可能是蓝斑但是不够清晰，可以把板放在4度几小时再观察。
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仕不可不弘毅，任重而道远
4楼2011-04-20 12:47:03
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zwlr116812

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
reasonspare(金币+2): 谢谢分享 2011-04-21 11:29:07
引用回帖:
Originally posted by 南海所老龚 at 2011-04-20 10:23:58:
你好，谢谢你细心的解答。
看完你的解疑之后，我又发现一个新问题：假阳性白斑是怎么生成的？是做连接的时候，载体不是与目的片段连接或者只连接了目的片段的一部分？还有是不是载体自连？我对载体自连不是很 ...

如果用的是单酶切，切口是粘性末端，加入连接酶后就很容易自连，如果用的是双酶切，自连的几率就没那么高，做转化时可以做个对照，只加酶切后的载体，不加目的片段，连接酶 buffer 都同样加，如果有大量菌落长出，那就是自连的几率很大
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5楼2011-04-21 10:53:52
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shandongfmmu

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
lstt09nk(金币+2): 热心 2011-04-26 22:36:43
蓝色不是目的菌落，是不存在假阳性的～感觉最好是做完酶切后，和质粒跑电泳做对照看是否切开了，做连接的时候做上阴性对照，也就是说只用切过的载体而不加片段，如果连接组和空载体组都有菌落并且差不多多，就可能是假阳性；如果连接组有菌落，而空载体组没有或者明显少很多，那应该是成功的！祝你成功！
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快乐~~~~~~~
6楼2011-04-22 00:25:15
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南海所老龚

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by zwlr116812 at 2011-04-21 10:53:52:
如果用的是单酶切，切口是粘性末端，加入连接酶后就很容易自连，如果用的是双酶切，自连的几率就没那么高，做转化时可以做个对照，只加酶切后的载体，不加目的片段，连接酶 buffer 都同样加，如果有大量菌落长 ...

谢谢
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7楼2011-04-22 10:37:45
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冬虫夏草1

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

要注意呀，白斑可不一定都是转化成功的，可能是载体自连接导致半乳糖苷酶失活，即所谓的假阳性。下面要做的事是酶切，鉴定有无目的条带。
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倚楼听风雨，淡看江湖路！
8楼2011-04-22 11:54:48
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

让一切随风飞翔

【答案】应助回帖

★
lstt09nk(金币+1): 感谢参与 2011-04-26 22:37:06
假阳性还有一种可能就是连接上了其他非目的片段，菌落也显白色，但是不是阳性克隆。
你说的蓝色菌落有目的基因我们可以称之为“假阴性”，主要是由于外源片段较短， 没有完全阻断LacZ的表达
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一直向前！
9楼2011-04-26 16:36:03
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