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早冰124

新虫 (初入文坛)

[求助] 蓝白斑筛选只长白斑

蓝白斑筛选,pUC19检测感受态细胞是转化效率很高,蓝白斑筛选后均为蓝斑,但为何连接产物转化后全是白斑,一个蓝斑都没有,并且菌落PCR检测所有的白色菌落均批不出目的条带,这是什么原因,更奇怪的是BL21做感受态细胞时只出现蓝斑,TOP10做感受态细胞时全是白斑,求解,非常感谢啊!
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xmuring

木虫 (著名写手)


【答案】应助回帖

★ ★ ★
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西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-20 18:41:45
早冰124: 金币+1, 有帮助 2012-05-21 14:51:18
BL21的lacZ基因在基因组上,在IPTG/Xgal平板上本身就是形成蓝色菌落,而TOP10则是通过质粒和基因组的lac基因片段之间α互补才会产生蓝斑。会不会是克隆没做好,连接失败了?lz是否重复过克隆过程?还有就是抗生素会不会有问题。。。另外,菌落PCR用的引物是M13通用引物还是自己设计的?建议lz说的详细点~~~~一不小心就写了这么多,lz多包涵下
3楼2012-05-20 17:01:20
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damaomao

禁虫 (正式写手)

感谢参与,应助指数 +1
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2楼2012-05-20 10:37:49
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早冰124

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by damaomao at 2012-05-20 10:37:49:
我建议重新要宿主菌  有可能宿主菌出问题了

BL21和Top10都是新买来的,经pUC19转化检测发现转化效率很好,怒视菌的问题
4楼2012-05-21 14:35:49
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早冰124

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by xmuring at 2012-05-20 17:01:20:
BL21的lacZ基因在基因组上,在IPTG/Xgal平板上本身就是形成蓝色菌落,而TOP10则是通过质粒和基因组的lac基因片段之间α互补才会产生蓝斑。会不会是克隆没做好,连接失败了?lz是否重复过克隆过程?还有就是抗生素会

连接转化次数已经做了10次了,起初发现是菌体的问题,后来菌体全换新的了,我用的载体是pGEX-4T1,大约5Kb,经BamHI和SalI双酶切处理,目的片段3Kb,重组质粒大约8Kb,转化BL21(DE3)发现只长蓝斑且菌体较少,转化top10后全为白斑,菌体较多些。但是无论是白斑和蓝斑均做过colony PCR,没有批出目的条带,同时挑选部分菌落培养提取质粒,最终发现质粒在5~6Kb之间,但是连接转化之前有做过l连接产物电泳检测,发现有时在7、8或10Kb之间都出现过条带,但是菌却长得很奇怪,如果说是氨苄问题那也不能解释这个原因啊
5楼2012-05-21 14:49:12
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