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xiaopeiliang

金虫 (小有名气)

[求助] 连接问题求助高手

最近在做一个连接，载体单酶切后，直接用T4连接酶连接涂板后居然不长，去磷酸化后就更不长了,更不要提连接目的片段的体系了，求解，纠结非常
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1楼 2013-11-05 21:08:04
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-06 10:17:27
xiaopeiliang: 金币+2, ★有帮助, 载体对照没有问题，其它的也尝试过啦 2013-11-06 22:52:22
第一：做个没有酶切的载体转化感受态做对照；第二：连接酶连其他东西看是不是失效；第三：抗生素有没有搞错；第四：培养条件是否正确；第五：转化条件是否正确。确定了这些问题之后，肯定会找到原因。
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4楼2013-11-06 08:55:15
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-11-06 08:28:22
xiaopeiliang: 金币+2, ★有帮助, 尝试不同去磷酸化量就是为了不过度去磷酸化，想找个合适的量，能够让载体自连几个，不知道合理不，其它的都尝试过啦，不是原因 2013-11-06 22:51:23
确定T4 ligase是不是失效了。载体单酶切连接发生自连，去磷酸化是为了避免自连，当然不会长了。另外，你的感受态细胞是否好用，是否转了为经酶切的载体质粒作为正对照？
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3楼2013-11-06 07:44:23
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liutong1026

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-07 22:22:19
xiaopeiliang: 金币+3, ★有帮助, 好的尝试下 2013-11-08 11:15:06
自己的经验，pcr、酶切、连接一天做完，（类似T克隆请注意加A）,可以试下四度连过夜，然后16度半天（5小时吧）这样可能长得不太多但阳性近乎100%，感受态不要反复融
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10楼2013-11-07 21:12:22
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
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xiaopeiliang: 金币+1, 这个可以排除了 2013-11-06 22:49:38
请检查一下载体的抗性
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-11-06 01:42:58
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bingdong05

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-06 10:17:39
xiaopeiliang: 金币+2, ★有帮助, 这些都常规的尝试过啦 2013-11-06 22:53:24
感受态木有问题的前提下，首先看下抗性是否正确，加的量是否过多；二，转化时利用空载体做个对照；三，检查载体和目的片段的比例是否合适，一般在1:3到1:10之间。
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5楼2013-11-06 09:32:33
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xiaopeiliang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-11-06 01:42:58
请检查一下载体的抗性

这个可以排除了。。。
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6楼2013-11-06 22:49:17
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-06 07:44:23
确定T4 ligase是不是失效了。载体单酶切连接发生自连，去磷酸化是为了避免自连，当然不会长了。另外，你的感受态细胞是否好用，是否转了为经酶切的载体质粒作为正对照？

我不明白你的意思。去磷酸化的目的就是完全避免载体自连的。不知道所谓过度是什么意思。自连的载体就是你原来的质粒，这个你要来干什么？
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7楼2013-11-07 05:55:13
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-07 15:56:27
感受态细胞效率非常低，甚至死了--比如保存前没加甘油；抗性不对；质粒处理过程被DNA酶降解了。否则，怎么酶切连接处理后转化，至少有几个质粒被转出来。
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为什么
8楼2013-11-07 08:33:58
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冷眼倦天涯

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-07 15:56:33
确定T4连接酶没有问题，或者buffer之类的没有问题，如果都没有问题，再连接一次啊试试！！！单酶切应该容易连接才对
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9楼2013-11-07 15:45:52
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