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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接问题求助高手
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xiaopeiliang

金虫 (小有名气)

[求助] 连接问题求助高手

最近在做一个连接，载体单酶切后，直接用T4连接酶连接涂板后居然不长，去磷酸化后就更不长了,更不要提连接目的片段的体系了，求解，纠结非常
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1楼 2013-11-05 21:08:04
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liutong1026

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-07 22:22:19
xiaopeiliang: 金币+3, ★有帮助, 好的尝试下 2013-11-08 11:15:06
自己的经验，pcr、酶切、连接一天做完，（类似T克隆请注意加A）,可以试下四度连过夜，然后16度半天（5小时吧）这样可能长得不太多但阳性近乎100%，感受态不要反复融
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10楼2013-11-07 21:12:22
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xiaopeiliang: 金币+1, 这个可以排除了 2013-11-06 22:49:38
请检查一下载体的抗性
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-11-06 01:42:58
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-11-06 08:28:22
xiaopeiliang: 金币+2, ★有帮助, 尝试不同去磷酸化量就是为了不过度去磷酸化，想找个合适的量，能够让载体自连几个，不知道合理不，其它的都尝试过啦，不是原因 2013-11-06 22:51:23
确定T4 ligase是不是失效了。载体单酶切连接发生自连，去磷酸化是为了避免自连，当然不会长了。另外，你的感受态细胞是否好用，是否转了为经酶切的载体质粒作为正对照？
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3楼2013-11-06 07:44:23
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wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-06 10:17:27
xiaopeiliang: 金币+2, ★有帮助, 载体对照没有问题，其它的也尝试过啦 2013-11-06 22:52:22
第一：做个没有酶切的载体转化感受态做对照；第二：连接酶连其他东西看是不是失效；第三：抗生素有没有搞错；第四：培养条件是否正确；第五：转化条件是否正确。确定了这些问题之后，肯定会找到原因。
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4楼2013-11-06 08:55:15
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