24小时热门版块排行榜    

查看: 2066  |  回复: 10
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

xiaopeiliang

金虫 (小有名气)

[求助] 连接问题求助高手

最近在做一个连接,载体单酶切后,直接用T4连接酶连接涂板后居然不长,去磷酸化后就更不长了,更不要提连接目的片段的体系了,求解,纠结非常
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liutong1026

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-07 22:22:19
xiaopeiliang: 金币+3, 有帮助, 好的尝试下 2013-11-08 11:15:06
自己的经验,pcr、酶切、连接一天做完,(类似T克隆请注意加A),可以试下四度连过夜,然后16度半天(5小时吧)这样可能长得不太多但阳性近乎100%,感受态不要反复融
10楼2013-11-07 21:12:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
xiaopeiliang: 金币+1, 这个可以排除了 2013-11-06 22:49:38
请检查一下载体的抗性
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-11-06 01:42:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-11-06 08:28:22
xiaopeiliang: 金币+2, 有帮助, 尝试不同去磷酸化量就是为了不过度去磷酸化,想找个合适的量,能够让载体自连几个,不知道合理不,其它的都尝试过啦,不是原因 2013-11-06 22:51:23
确定T4 ligase是不是失效了。载体单酶切连接发生自连,去磷酸化是为了避免自连,当然不会长了。另外,你的感受态细胞是否好用,是否转了为经酶切的载体质粒作为正对照?
3楼2013-11-06 07:44:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-06 10:17:27
xiaopeiliang: 金币+2, 有帮助, 载体对照没有问题,其它的也尝试过啦 2013-11-06 22:52:22
第一:做个没有酶切的载体转化感受态做对照;第二:连接酶连其他东西看是不是失效;第三:抗生素有没有搞错;第四:培养条件是否正确;第五:转化条件是否正确。确定了这些问题之后,肯定会找到原因。
4楼2013-11-06 08:55:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的? +12 爱看书的可乐 2026-08-26 14/700 2026-08-26 15:48 by coolysnow
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +9 炎黄贵胄 2026-08-22 10/500 2026-08-26 15:40 by semaglutide
[基金申请] 我不理解! +8 Edward_pc 2026-08-26 13/650 2026-08-26 15:37 by Tide man
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +6 process2012 2026-08-23 9/450 2026-08-26 15:33 by process2012
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +23 koalala 2026-08-24 26/1300 2026-08-26 14:29 by 宝贝虫子
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +26 yaoyewhu2008 2026-08-20 28/1400 2026-08-26 13:49 by zzuzxg
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 国际合作可查了,中了面上 +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 项目信息和经费信息在系统里都可以看到了 +6 wittyboy 2026-08-26 14/700 2026-08-26 10:55 by wittyboy
[基金申请] 国合可查了 +3 paperzjh 2026-08-26 3/150 2026-08-26 10:41 by LemmonTr
[基金申请] 国合现在查不到了吗? +10 chengyan1220 2026-08-24 20/1000 2026-08-26 08:57 by peasantsprig
[基金申请] 明天应该可查了!? +6 chengyan1220 2026-08-23 6/300 2026-08-25 19:45 by zfd97
[基金申请] 有没有大神帮我看看基金代码 28+4 1234567wang 2026-08-24 10/500 2026-08-25 19:15 by lfy8008
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +9 图啦图啦 2026-08-24 10/500 2026-08-25 11:59 by 南海小哥
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +13 kulium 2026-08-21 16/800 2026-08-24 16:27 by superceng
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办? +5 简单化xn 2026-08-22 10/500 2026-08-23 12:38 by 简单化xn
[基金申请] 时间戳今天,20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 看来今天不会放榜了? +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧? +4 哈哈蛤? 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
信息提示
请填处理意见