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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 平末端加A尾连接T载体的问题
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猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)

[求助] 平末端加A尾连接T载体的问题 已有4人参与

各位亲，打搅了

我现在有一段融合片段想要连接T载体，用的是primer star所以产物是平末端，因为同学都反应平末端连接效率低，所以想加A尾巴再连接T载体。

加A尾时用的是TAKARA的DNA A-Tailing Kit，加A尾的体系如下：

buffer    5微
dNTP     4微
A-Tailing enzyme   0.5微
平末端DNA片段      约600ng（试剂盒的要求是达到0.5~5微克）
水          up  to 50微

我的片段长度有3740bp，与T载体连接时间为：16度2个半小时。

转入DH5a后，在氨苄蓝白斑平板上筛选到白色的菌落进行菌落PCR、提质粒、酶切验证。
酶切的结果不理想，空载体的大小为2692bp，酶切得到的片段大小为3500bp左右，我想问的是：
1.有人说连接的片段大于载体的大小会很难连，是这样吗？
2.酶切结果好像是只连上了一部分，是否是16度的反应时间太短？（说明书上写“长片段（2kb以上）进行克隆时，连接反应请延长至数小时。”咨询了TAKARA，说3740的片段要连多长时间，回复说不要超过3个小时。）
3.平末端连接是否还有更好的方法或者是经验，对于4000bp左右的平末端片段，怎样更有效的连上载体呢？

谢谢各位。
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1楼 2013-10-26 12:33:23
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tanche163

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2013-10-28 00:49:12
很简单，注意一个细节：加完a尾后一定要切胶回收，去除小片段，因为小片段也有a尾，容易优先连接t载体，导致空载。至于片段大小，我连过5kb，没有问题。另外普通PCR体系加a尾也很好用，没必要买小日本的试剂盒，太贵了
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阳光总在风雨后
3楼2013-10-27 22:42:36
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lcat

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-27 17:50:28
1 大片段确实比小片段难连接
2 怎么会“只连上一部分“呢？一般是要么连上，要么没连上啊。是不是用的酶有两个切点，正好把重组质粒切成两个3500bp左右的片段了？如果排除这个可能的话，只有多挑取转化子继续验证了。
3 实在不行可以用一些公司出的平端的克隆载体，直接往上连就行。
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2楼2013-10-27 16:51:41
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猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by tanche163 at 2013-10-27 22:42:36
很简单，注意一个细节：加完a尾后一定要切胶回收，去除小片段，因为小片段也有a尾，容易优先连接t载体，导致空载。至于片段大小，我连过5kb，没有问题。另外普通PCR体系加a尾也很好用，没必要买小日本的试剂盒，太贵 ...

请问一下，加尾的时候我用的是胶回收的产物，胶回收本来就损失比较大，加完A后再跑胶胶回收，会不会得到的产物更少呢？克隆的时候要求目的片段要达到一定的浓度嘛，这样会不会有影响？
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4楼2013-10-28 19:22:20
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tanche163

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-29 16:37:15
猫di阁楼: 金币+1, ★有帮助 2013-10-30 21:20:45
引用回帖:
4楼: Originally posted by 猫di阁楼 at 2013-10-28 19:22:20
请问一下，加尾的时候我用的是胶回收的产物，胶回收本来就损失比较大，加完A后再跑胶胶回收，会不会得到的产物更少呢？克隆的时候要求目的片段要达到一定的浓度嘛，这样会不会有影响？...

PCR产物可以直接用纯化试剂盒先纯化一下，因为无论怎么操作都会伴随有断裂的DNA片段，这时候加a尾这些小片段也会被补齐并产生a尾，由于这些片段大小比目的片段小，所以会优先连接到T载体，因此加完a尾后一定要胶回收，你的“酶切结果好像是只连上了一部分”实际上就是断裂的小片段。
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阳光总在风雨后
5楼2013-10-29 14:17:38
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ytetyio09

新虫 (正式写手)

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★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-09-08 20:06:08
可以试试这篇论文的方法，虽然是个小的改进，但是值得一试，而且很方便：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24613256
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7楼2014-03-25 18:53:52
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普通回帖

huoyongting

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-29 16:37:25
猫di阁楼: 金币+1, ★有帮助 2013-10-30 21:20:56
引用回帖:
4楼: Originally posted by 猫di阁楼 at 2013-10-28 19:22:20
请问一下，加尾的时候我用的是胶回收的产物，胶回收本来就损失比较大，加完A后再跑胶胶回收，会不会得到的产物更少呢？克隆的时候要求目的片段要达到一定的浓度嘛，这样会不会有影响？...

回收是必须的，但是我觉得没必要跑胶，直接用纯化柱回收就好了，小片段挂不上柱，我做过N次了，没问题
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6楼2013-10-29 16:35:22
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南海所老龚

新虫 (正式写手)
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-09-08 20:06:12
引用回帖:
3楼: Originally posted by tanche163 at 2013-10-27 22:42:36
很简单，注意一个细节：加完a尾后一定要切胶回收，去除小片段，因为小片段也有a尾，容易优先连接t载体，导致空载。至于片段大小，我连过5kb，没有问题。另外普通PCR体系加a尾也很好用，没必要买小日本的试剂盒，太贵 ...

亲，你好，看了你在小木虫上的留言，连接5K片段都不成问题，很是佩服。我最近深受克隆的摧残，片段2500 bp左右，一直克隆不上，向虫友学习，希望不吝赐教。期待您的回复，祝好！
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TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.
8楼2014-07-03 16:21:02
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三撇五撇

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-09-08 20:06:17
长片段平末端连接效率是有点低，一般遇到长片段连接，我基本上是过夜连接，第二天转化，效果会好很多。基本上的2K~5K左右的都遇到过，都能搞定。
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9楼2014-09-07 21:43:52
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yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-09-08 20:06:20
我们用的克隆材料就不用加A什么的，直接TAQ酶的PCR后，回收连接，做过1.5Kb的连接，长片段较短片段转化率确实是低点儿。
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学习使你立于不败之地
10楼2014-09-08 17:06:20
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