应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 平末端加A尾连接T载体的问题
151/2返回列表12下一页
查看: 8986  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)

[求助] 平末端加A尾连接T载体的问题 已有4人参与

各位亲，打搅了

我现在有一段融合片段想要连接T载体，用的是primer star所以产物是平末端，因为同学都反应平末端连接效率低，所以想加A尾巴再连接T载体。

加A尾时用的是TAKARA的DNA A-Tailing Kit，加A尾的体系如下：

buffer    5微
dNTP     4微
A-Tailing enzyme   0.5微
平末端DNA片段      约600ng（试剂盒的要求是达到0.5~5微克）
水          up  to 50微

我的片段长度有3740bp，与T载体连接时间为：16度2个半小时。

转入DH5a后，在氨苄蓝白斑平板上筛选到白色的菌落进行菌落PCR、提质粒、酶切验证。
酶切的结果不理想，空载体的大小为2692bp，酶切得到的片段大小为3500bp左右，我想问的是：
1.有人说连接的片段大于载体的大小会很难连，是这样吗？
2.酶切结果好像是只连上了一部分，是否是16度的反应时间太短？（说明书上写“长片段（2kb以上）进行克隆时，连接反应请延长至数小时。”咨询了TAKARA，说3740的片段要连多长时间，回复说不要超过3个小时。）
3.平末端连接是否还有更好的方法或者是经验，对于4000bp左右的平末端片段，怎样更有效的连上载体呢？

谢谢各位。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

蛋白表达纯化鉴定精华

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-10-26 12:33:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

tanche163

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2013-10-28 00:49:12
很简单，注意一个细节：加完a尾后一定要切胶回收，去除小片段，因为小片段也有a尾，容易优先连接t载体，导致空载。至于片段大小，我连过5kb，没有问题。另外普通PCR体系加a尾也很好用，没必要买小日本的试剂盒，太贵了
赞一下(2人) 回复此楼
阳光总在风雨后
3楼2013-10-27 22:42:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lcat

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-27 17:50:28
1 大片段确实比小片段难连接
2 怎么会“只连上一部分“呢？一般是要么连上，要么没连上啊。是不是用的酶有两个切点，正好把重组质粒切成两个3500bp左右的片段了？如果排除这个可能的话，只有多挑取转化子继续验证了。
3 实在不行可以用一些公司出的平端的克隆载体，直接往上连就行。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2013-10-27 16:51:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by tanche163 at 2013-10-27 22:42:36
很简单，注意一个细节：加完a尾后一定要切胶回收，去除小片段，因为小片段也有a尾，容易优先连接t载体，导致空载。至于片段大小，我连过5kb，没有问题。另外普通PCR体系加a尾也很好用，没必要买小日本的试剂盒，太贵 ...

请问一下，加尾的时候我用的是胶回收的产物，胶回收本来就损失比较大，加完A后再跑胶胶回收，会不会得到的产物更少呢？克隆的时候要求目的片段要达到一定的浓度嘛，这样会不会有影响？
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2013-10-28 19:22:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tanche163

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-29 16:37:15
猫di阁楼: 金币+1, ★有帮助 2013-10-30 21:20:45
引用回帖:
4楼: Originally posted by 猫di阁楼 at 2013-10-28 19:22:20
请问一下，加尾的时候我用的是胶回收的产物，胶回收本来就损失比较大，加完A后再跑胶胶回收，会不会得到的产物更少呢？克隆的时候要求目的片段要达到一定的浓度嘛，这样会不会有影响？...

PCR产物可以直接用纯化试剂盒先纯化一下，因为无论怎么操作都会伴随有断裂的DNA片段，这时候加a尾这些小片段也会被补齐并产生a尾，由于这些片段大小比目的片段小，所以会优先连接到T载体，因此加完a尾后一定要胶回收，你的“酶切结果好像是只连上了一部分”实际上就是断裂的小片段。
赞一下(1人) 回复此楼
阳光总在风雨后
5楼2013-10-29 14:17:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ytetyio09

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-09-08 20:06:08
可以试试这篇论文的方法，虽然是个小的改进，但是值得一试，而且很方便：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24613256
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2014-03-25 18:53:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

huoyongting

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-29 16:37:25
猫di阁楼: 金币+1, ★有帮助 2013-10-30 21:20:56
引用回帖:
4楼: Originally posted by 猫di阁楼 at 2013-10-28 19:22:20
请问一下，加尾的时候我用的是胶回收的产物，胶回收本来就损失比较大，加完A后再跑胶胶回收，会不会得到的产物更少呢？克隆的时候要求目的片段要达到一定的浓度嘛，这样会不会有影响？...

回收是必须的，但是我觉得没必要跑胶，直接用纯化柱回收就好了，小片段挂不上柱，我做过N次了，没问题
赞一下 回复此楼
6楼2013-10-29 16:35:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

南海所老龚

新虫 (正式写手)
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-09-08 20:06:12
引用回帖:
3楼: Originally posted by tanche163 at 2013-10-27 22:42:36
很简单，注意一个细节：加完a尾后一定要切胶回收，去除小片段，因为小片段也有a尾，容易优先连接t载体，导致空载。至于片段大小，我连过5kb，没有问题。另外普通PCR体系加a尾也很好用，没必要买小日本的试剂盒，太贵 ...

亲，你好，看了你在小木虫上的留言，连接5K片段都不成问题，很是佩服。我最近深受克隆的摧残，片段2500 bp左右，一直克隆不上，向虫友学习，希望不吝赐教。期待您的回复，祝好！
赞一下 回复此楼
TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.
8楼2014-07-03 16:21:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三撇五撇

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-09-08 20:06:17
长片段平末端连接效率是有点低，一般遇到长片段连接，我基本上是过夜连接，第二天转化，效果会好很多。基本上的2K~5K左右的都遇到过，都能搞定。
赞一下 回复此楼
9楼2014-09-07 21:43:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-09-08 20:06:20
我们用的克隆材料就不用加A什么的，直接TAQ酶的PCR后，回收连接，做过1.5Kb的连接，长片段较短片段转化率确实是低点儿。
赞一下 回复此楼
学习使你立于不败之地
10楼2014-09-08 17:06:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 猫di阁楼 的主题更新
151/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 298-一志愿中国农业大学-求调剂 +11 手机用户 2026-03-17 12/600 2026-03-23 23:51 by 热情沙漠
[考研] 341求调剂(一志愿湖南大学070300) +5 番茄头--- 2026-03-22 6/300 2026-03-23 23:45 by Txy@872106
[考研] 一志愿国科过程所081700，274求调剂 +3 三水研0水立方 2026-03-23 3/150 2026-03-23 23:11 by MajorWen
[考研] 材料/农业专业，07/08开头均可，过线就行 +3 呵唔哦豁 2026-03-23 4/200 2026-03-23 22:30 by 汪！？！
[考研] 361求调剂 +3 Glack 2026-03-22 3/150 2026-03-23 22:03 by fuyu_
[考研] 一志愿南航材料专317分求调剂 +3 炸呀炸呀炸薯条 2026-03-23 3/150 2026-03-23 20:47 by pswait
[考研] 0854电子信息求调剂 324 +3 Promise-jyl 2026-03-23 3/150 2026-03-23 13:43 by wangkm
[考研] 求调剂材料学硕080500，总分289分 5+3 @taotao 2026-03-19 21/1050 2026-03-23 10:17 by 冠c哥
[考研] 311求调剂 +6 冬十三 2026-03-18 6/300 2026-03-22 20:18 by edmund7
[考研] 求调剂一志愿海大，0703化学学硕304分，有大创项目，四级已过 +6 幸运哩哩 2026-03-22 10/500 2026-03-22 20:10 by edmund7
[考研] 生物学调剂 +5 Surekei 2026-03-21 5/250 2026-03-22 14:39 by tcx007
[考研] 286求调剂 +10 Faune 2026-03-21 10/500 2026-03-21 23:34 by 314126402
[考研] 0703化学调剂 +4 妮妮ninicgb 2026-03-21 4/200 2026-03-21 18:39 by 学员8dgXkO
[考研] 一志愿华南师大 070300（化学）304分求调剂 +3 0703武芊慧雪304 2026-03-18 3/150 2026-03-21 00:48 by JourneyLucky
[考研] 329求调剂 +9 想上学吖吖 2026-03-19 9/450 2026-03-20 22:01 by luoyongfeng
[考研] 353求调剂 +3 拉钩不许变 2026-03-20 3/150 2026-03-20 19:56 by JourneyLucky
[考研] 一志愿南理工085701环境302求调剂院校 +3 葵梓卫队 2026-03-20 3/150 2026-03-20 19:28 by zhukairuo
[考研] 0856调剂，是学校就去 +8 sllhht 2026-03-19 9/450 2026-03-20 14:25 by 无懈可击111
[考博] 申博26年 +3 八6八68 2026-03-19 3/150 2026-03-19 19:43 by nxgogo
[考研] 材料，纺织，生物（0856、0710），化学招生啦 +3 Eember. 2026-03-17 9/450 2026-03-18 10:28 by Eember.
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭