应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 平末端加A尾连接T载体的问题
汕头大学海洋科学接受调剂
151/2返回列表12下一页
查看: 9098  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)

[求助] 平末端加A尾连接T载体的问题 已有4人参与

各位亲，打搅了

我现在有一段融合片段想要连接T载体，用的是primer star所以产物是平末端，因为同学都反应平末端连接效率低，所以想加A尾巴再连接T载体。

加A尾时用的是TAKARA的DNA A-Tailing Kit，加A尾的体系如下：

buffer    5微
dNTP     4微
A-Tailing enzyme   0.5微
平末端DNA片段      约600ng（试剂盒的要求是达到0.5~5微克）
水          up  to 50微

我的片段长度有3740bp，与T载体连接时间为：16度2个半小时。

转入DH5a后，在氨苄蓝白斑平板上筛选到白色的菌落进行菌落PCR、提质粒、酶切验证。
酶切的结果不理想，空载体的大小为2692bp，酶切得到的片段大小为3500bp左右，我想问的是：
1.有人说连接的片段大于载体的大小会很难连，是这样吗？
2.酶切结果好像是只连上了一部分，是否是16度的反应时间太短？（说明书上写“长片段（2kb以上）进行克隆时，连接反应请延长至数小时。”咨询了TAKARA，说3740的片段要连多长时间，回复说不要超过3个小时。）
3.平末端连接是否还有更好的方法或者是经验，对于4000bp左右的平末端片段，怎样更有效的连上载体呢？

谢谢各位。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

蛋白表达纯化鉴定精华

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-10-26 12:33:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

tanche163

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2013-10-28 00:49:12
很简单，注意一个细节：加完a尾后一定要切胶回收，去除小片段，因为小片段也有a尾，容易优先连接t载体，导致空载。至于片段大小，我连过5kb，没有问题。另外普通PCR体系加a尾也很好用，没必要买小日本的试剂盒，太贵了
赞一下(2人) 回复此楼
阳光总在风雨后
3楼2013-10-27 22:42:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lcat

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-27 17:50:28
1 大片段确实比小片段难连接
2 怎么会“只连上一部分“呢？一般是要么连上，要么没连上啊。是不是用的酶有两个切点，正好把重组质粒切成两个3500bp左右的片段了？如果排除这个可能的话，只有多挑取转化子继续验证了。
3 实在不行可以用一些公司出的平端的克隆载体，直接往上连就行。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2013-10-27 16:51:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by tanche163 at 2013-10-27 22:42:36
很简单，注意一个细节：加完a尾后一定要切胶回收，去除小片段，因为小片段也有a尾，容易优先连接t载体，导致空载。至于片段大小，我连过5kb，没有问题。另外普通PCR体系加a尾也很好用，没必要买小日本的试剂盒，太贵 ...

请问一下，加尾的时候我用的是胶回收的产物，胶回收本来就损失比较大，加完A后再跑胶胶回收，会不会得到的产物更少呢？克隆的时候要求目的片段要达到一定的浓度嘛，这样会不会有影响？
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2013-10-28 19:22:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tanche163

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-29 16:37:15
猫di阁楼: 金币+1, ★有帮助 2013-10-30 21:20:45
引用回帖:
4楼: Originally posted by 猫di阁楼 at 2013-10-28 19:22:20
请问一下，加尾的时候我用的是胶回收的产物，胶回收本来就损失比较大，加完A后再跑胶胶回收，会不会得到的产物更少呢？克隆的时候要求目的片段要达到一定的浓度嘛，这样会不会有影响？...

PCR产物可以直接用纯化试剂盒先纯化一下，因为无论怎么操作都会伴随有断裂的DNA片段，这时候加a尾这些小片段也会被补齐并产生a尾，由于这些片段大小比目的片段小，所以会优先连接到T载体，因此加完a尾后一定要胶回收，你的“酶切结果好像是只连上了一部分”实际上就是断裂的小片段。
赞一下(1人) 回复此楼
阳光总在风雨后
5楼2013-10-29 14:17:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ytetyio09

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-09-08 20:06:08
可以试试这篇论文的方法，虽然是个小的改进，但是值得一试，而且很方便：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24613256
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2014-03-25 18:53:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

huoyongting

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-29 16:37:25
猫di阁楼: 金币+1, ★有帮助 2013-10-30 21:20:56
引用回帖:
4楼: Originally posted by 猫di阁楼 at 2013-10-28 19:22:20
请问一下，加尾的时候我用的是胶回收的产物，胶回收本来就损失比较大，加完A后再跑胶胶回收，会不会得到的产物更少呢？克隆的时候要求目的片段要达到一定的浓度嘛，这样会不会有影响？...

回收是必须的，但是我觉得没必要跑胶，直接用纯化柱回收就好了，小片段挂不上柱，我做过N次了，没问题
赞一下 回复此楼
6楼2013-10-29 16:35:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

南海所老龚

新虫 (正式写手)
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-09-08 20:06:12
引用回帖:
3楼: Originally posted by tanche163 at 2013-10-27 22:42:36
很简单，注意一个细节：加完a尾后一定要切胶回收，去除小片段，因为小片段也有a尾，容易优先连接t载体，导致空载。至于片段大小，我连过5kb，没有问题。另外普通PCR体系加a尾也很好用，没必要买小日本的试剂盒，太贵 ...

亲，你好，看了你在小木虫上的留言，连接5K片段都不成问题，很是佩服。我最近深受克隆的摧残，片段2500 bp左右，一直克隆不上，向虫友学习，希望不吝赐教。期待您的回复，祝好！
赞一下 回复此楼
TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.
8楼2014-07-03 16:21:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三撇五撇

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-09-08 20:06:17
长片段平末端连接效率是有点低，一般遇到长片段连接，我基本上是过夜连接，第二天转化，效果会好很多。基本上的2K~5K左右的都遇到过，都能搞定。
赞一下 回复此楼
9楼2014-09-07 21:43:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-09-08 20:06:20
我们用的克隆材料就不用加A什么的，直接TAQ酶的PCR后，回收连接，做过1.5Kb的连接，长片段较短片段转化率确实是低点儿。
赞一下 回复此楼
学习使你立于不败之地
10楼2014-09-08 17:06:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 猫di阁楼 的主题更新
151/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 327求调剂 +23 Xxjc1107. 2026-04-13 25/1250 2026-04-14 18:48 by 逍遥三郎
[考研] 一志愿中国科学院上海有机所，有机化学356分找调剂 +12 Nadiums 2026-04-09 13/650 2026-04-14 17:54 by lhj2009
[考研] 一志愿085502，267分求调剂 +19 再忙也要吃饭啊 2026-04-08 20/1000 2026-04-14 16:03 by zs92450
[考研] 296求调剂 +8 汪！？！ 2026-04-09 9/450 2026-04-14 15:15 by 逆水乘风
[考研] 求调剂 +20 MAX怅惘 2026-04-09 22/1100 2026-04-14 14:57 by 独醉梦孤城
[考研] 2026硕士调剂_能动_河南农业大学 +4 河南农业大学-能 2026-04-12 4/200 2026-04-13 22:01 by bljnqdcc
[考研] 一志愿211 0703化学 346分求调剂 +26 土豆er? 2026-04-09 29/1450 2026-04-13 15:15 by 独醉梦孤城
[考研] 一志愿鲁东大学071000生物学学硕初试分数276求调剂 +8 慕绝cc 2026-04-09 8/400 2026-04-13 14:08 by 张zhihao
[考研] 求调剂，一志愿材料科学与工程985，365分， +8 材化李可 2026-04-11 10/500 2026-04-12 08:42 by 852137818
[找工作] 山东高校教师考核超级无底线，员工过不下去啦 +4 qut2026 2026-04-09 9/450 2026-04-12 00:54 by qut2026
[考研] 0859，337求调剂 +4 研s. 2026-04-10 4/200 2026-04-11 11:34 by caotw2020
[考研] 283求调剂 +22 那个噜子 2026-04-09 22/1100 2026-04-11 10:41 by 逆水乘风
[考研] 22408调剂求助 +7 毂12 2026-04-09 9/450 2026-04-11 09:23 by 哦哦123
[考研] 337求调剂 +4 研s. 2026-04-10 4/200 2026-04-11 08:57 by zhq0425
[考研] 调剂 +12 卷卷卷心菜_ 2026-04-09 13/650 2026-04-10 22:36 by Ftglcn90
[考研] 求调剂 +5 不会飞的鱼@ 2026-04-10 5/250 2026-04-10 19:07 by chemisry
[考研] 一志愿京区985，085401，与本科专业一致，电子信息工程， +4 阳光开朗的男孩 2026-04-10 4/200 2026-04-10 18:27 by shenrf
[考研] 初试分332，一志愿报考西北工业大学， +11 故人?? 2026-04-09 11/550 2026-04-09 21:54 by JineShine
[考研] 考研调剂-材料类-284 +28 想换手机不想解� 2026-04-08 28/1400 2026-04-09 20:08 by 倒数321?
[考研] 331求调剂 +5 luoxin0706. 2026-04-08 5/250 2026-04-08 22:15 by zhouyuwinner
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭