应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 平末端加A尾连接T载体的问题
51/1返回列表
查看: 9022  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)

[求助] 平末端加A尾连接T载体的问题 已有4人参与

各位亲，打搅了

我现在有一段融合片段想要连接T载体，用的是primer star所以产物是平末端，因为同学都反应平末端连接效率低，所以想加A尾巴再连接T载体。

加A尾时用的是TAKARA的DNA A-Tailing Kit，加A尾的体系如下：

buffer    5微
dNTP     4微
A-Tailing enzyme   0.5微
平末端DNA片段      约600ng（试剂盒的要求是达到0.5~5微克）
水          up  to 50微

我的片段长度有3740bp，与T载体连接时间为：16度2个半小时。

转入DH5a后，在氨苄蓝白斑平板上筛选到白色的菌落进行菌落PCR、提质粒、酶切验证。
酶切的结果不理想，空载体的大小为2692bp，酶切得到的片段大小为3500bp左右，我想问的是：
1.有人说连接的片段大于载体的大小会很难连，是这样吗？
2.酶切结果好像是只连上了一部分，是否是16度的反应时间太短？（说明书上写“长片段（2kb以上）进行克隆时，连接反应请延长至数小时。”咨询了TAKARA，说3740的片段要连多长时间，回复说不要超过3个小时。）
3.平末端连接是否还有更好的方法或者是经验，对于4000bp左右的平末端片段，怎样更有效的连上载体呢？

谢谢各位。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

蛋白表达纯化鉴定精华

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-10-26 12:33:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ytetyio09

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-09-08 20:06:08
可以试试这篇论文的方法，虽然是个小的改进，但是值得一试，而且很方便：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24613256
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2014-03-25 18:53:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答

lcat

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-27 17:50:28
1 大片段确实比小片段难连接
2 怎么会“只连上一部分“呢？一般是要么连上，要么没连上啊。是不是用的酶有两个切点，正好把重组质粒切成两个3500bp左右的片段了？如果排除这个可能的话，只有多挑取转化子继续验证了。
3 实在不行可以用一些公司出的平端的克隆载体，直接往上连就行。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2013-10-27 16:51:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tanche163

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2013-10-28 00:49:12
很简单，注意一个细节：加完a尾后一定要切胶回收，去除小片段，因为小片段也有a尾，容易优先连接t载体，导致空载。至于片段大小，我连过5kb，没有问题。另外普通PCR体系加a尾也很好用，没必要买小日本的试剂盒，太贵了
赞一下(2人) 回复此楼
阳光总在风雨后
3楼2013-10-27 22:42:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by tanche163 at 2013-10-27 22:42:36
很简单，注意一个细节：加完a尾后一定要切胶回收，去除小片段，因为小片段也有a尾，容易优先连接t载体，导致空载。至于片段大小，我连过5kb，没有问题。另外普通PCR体系加a尾也很好用，没必要买小日本的试剂盒，太贵 ...

请问一下，加尾的时候我用的是胶回收的产物，胶回收本来就损失比较大，加完A后再跑胶胶回收，会不会得到的产物更少呢？克隆的时候要求目的片段要达到一定的浓度嘛，这样会不会有影响？
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2013-10-28 19:22:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 292求调剂 +7 鹅鹅鹅额额额额� 2026-03-25 8/400 2026-03-26 00:22 by Dyhoer
[考研] 一志愿中南大学化学学硕0703总分337求调剂 +7 niko- 2026-03-22 7/350 2026-03-25 20:14 by qingfeng258
[考研] 321求调剂 +3 璞玉~~ 2026-03-25 3/150 2026-03-25 19:07 by Zhanglab-TJU
[考研] 材料277求调剂 +4 min3 2026-03-24 4/200 2026-03-25 15:29 by fch1983
[考研] 材料学硕，求调剂 6+4 糖葫芦888ll 2026-03-22 9/450 2026-03-25 11:19 by greychen00
[考研] 考研化学308分求调剂 +10 你好明天你好 2026-03-23 11/550 2026-03-25 10:23 by userper
[考研] 求调剂 一志愿 本科 北科大 化学 343 +4 13831862839 2026-03-24 5/250 2026-03-25 09:47 by 无际的草原
[考研] 318求调剂 +3 plum李子 2026-03-23 3/150 2026-03-25 09:42 by 雾散后相遇lc
[考研] 化学调剂 +6 yzysaa 2026-03-21 6/300 2026-03-25 09:27 by aa331100
[考研] 食品专硕 一志愿双一流 328 +3 xiaom99 2026-03-21 4/200 2026-03-24 21:20 by lailaisimei
[考研] 0854 考研调剂 招生了！AI 方向 +5 pk3725069 2026-03-19 17/850 2026-03-24 17:30 by zhouxuan..
[考研] 【双一流院校新能源、环境材料，材料加工与模拟招收大量调剂】 +4 Higraduate 2026-03-22 7/350 2026-03-24 11:23 by 种大树
[考研] 一志愿华东理工大学081700，初试分数271 +5 kotoko_ik 2026-03-23 6/300 2026-03-24 10:29 by 学术搬砖er
[考研] 344求调剂 +3 desto 2026-03-24 3/150 2026-03-24 10:09 by 搏击518
[考研] 生物学一志愿985，分数349求调剂 +6 zxts12 2026-03-21 9/450 2026-03-23 18:37 by macy2011
[考研] 352求调剂 +3 大米饭！ 2026-03-22 3/150 2026-03-22 23:28 by king123！
[考研] 一志愿东华大学化学070300，求调剂 +7 2117205181 2026-03-21 8/400 2026-03-22 22:55 by chixmc
[考研] 260求调剂 +3 朱芷琳 2026-03-20 4/200 2026-03-22 15:12 by 朱芷琳
[考研] 266求调剂 +3 哇呼哼呼哼 2026-03-20 3/150 2026-03-21 16:46 by barlinike
[考研] 一志愿武汉理工材料工程专硕调剂 +9 Doleres 2026-03-19 9/450 2026-03-20 22:36 by JourneyLucky
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭