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猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)

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[求助] 平末端加A尾连接T载体的问题已有4人参与

各位亲，打搅了

我现在有一段融合片段想要连接T载体，用的是primer star所以产物是平末端，因为同学都反应平末端连接效率低，所以想加A尾巴再连接T载体。

加A尾时用的是TAKARA的DNA A-Tailing Kit，加A尾的体系如下：

buffer 5微
dNTP    4微
A-Tailing enzyme 0.5微
平末端DNA片段    约600ng（试剂盒的要求是达到0.5~5微克）
水       up  to 50微

我的片段长度有3740bp，与T载体连接时间为：16度2个半小时。

转入DH5a后，在氨苄蓝白斑平板上筛选到白色的菌落进行菌落PCR、提质粒、酶切验证。
酶切的结果不理想，空载体的大小为2692bp，酶切得到的片段大小为3500bp左右，我想问的是：
1.有人说连接的片段大于载体的大小会很难连，是这样吗？
2.酶切结果好像是只连上了一部分，是否是16度的反应时间太短？（说明书上写“长片段（2kb以上）进行克隆时，连接反应请延长至数小时。”咨询了TAKARA，说3740的片段要连多长时间，回复说不要超过3个小时。）
3.平末端连接是否还有更好的方法或者是经验，对于4000bp左右的平末端片段，怎样更有效的连上载体呢？

谢谢各位。

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1楼 2013-10-26 12:33:23

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猫di阁楼

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引用回帖:

3楼: Originally posted by tanche163 at 2013-10-27 22:42:36
很简单，注意一个细节：加完a尾后一定要切胶回收，去除小片段，因为小片段也有a尾，容易优先连接t载体，导致空载。至于片段大小，我连过5kb，没有问题。另外普通PCR体系加a尾也很好用，没必要买小日本的试剂盒，太贵 ...

请问一下，加尾的时候我用的是胶回收的产物，胶回收本来就损失比较大，加完A后再跑胶胶回收，会不会得到的产物更少呢？克隆的时候要求目的片段要达到一定的浓度嘛，这样会不会有影响？