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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接频频出问题，有没有高人指点一下
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

[求助] 连接频频出问题，有没有高人指点一下 已有2人参与

本人要连一段1926bp的片段到T载体pMD19-T（2692bp）上面，按理说不算大片段吧，可是连接老连不上去，第一次连的时候考虑到目的片段回收后浓度不大，所以加大了模板的量，做了模板：T载体，5:1,7:1,10:1三个梯度，菌倒是长了不少，挑了5个单菌落，验证后发现都没有连上
昨天第二次连接，做了两种体系，连接体系如下：
体系一
模板：2ul
T载体：0.5ul
solution I：3.5ul
体系二
模板：2.5ul
T载体：0.5ul
solution I：3.5ul
连接时间10h，涂氨苄平板过夜
今天一看平板发现就体系一两个平板长了，加起来才三个菌落 还说不准三个都是阳性克隆挑出来了，准备明早验证了.
有谁推荐个体系麽，胶回收后点了5ul的模板跑了下看，感觉浓度还成，之前浓度更低都连得上，氨苄平板没问题的，新配的，浓度也没问题的，100ug/ml的终浓度，培养基冷却到50℃的时候才加进去的.
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1楼 2012-07-07 22:36:22
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jiuzi59

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
T载体应该好连啊，你的片段是用普通taq酶p的吗？因为它的3端会有个A尾巴，正好与T载体3端的T尾巴相连。你若是高保真酶p的，只能用平末端的T载体。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2012-07-08 04:47:02
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer
引用回帖:
2楼: Originally posted by jiuzi59 at 2012-07-08 04:47:02
T载体应该好连啊，你的片段是用普通taq酶p的吗？因为它的3端会有个A尾巴，正好与T载体3端的T尾巴相连。你若是高保真酶p的，只能用平末端的T载体。

Taq plus 自带A尾
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3楼2012-07-08 09:24:53
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review

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

我是回收片段后   加A   再连接   挺好的
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交流
4楼2012-10-26 16:05:09
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fuchange918

木虫 (正式写手)
请问你的片段最终连接上去了吗？我也出现和你一样的问题，连接转化了快10次了都没有成功
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5楼2014-07-06 09:50:40
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

你确定你的酶能加A吗？T载体的连接效率很高。
DNA的比例用摩尔比。
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6楼2014-07-06 13:22:33
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

做个阳性对照，确保感受态没有问题。另外可以增大一下酶连体系，10ul试一试增加碰撞几率。PS:T载体按说很好连的啊！祝好运

[ 发自小木虫客户端 ]
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天道酬勤
7楼2014-07-06 21:53:54
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