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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 希望高人指点迷津，关于蛋白质葡聚糖凝胶过柱问题
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jixiao_02

铜虫 (小有名气)

[求助] 希望高人指点迷津，关于蛋白质葡聚糖凝胶过柱问题

我过凝胶柱过了好几遍了，用的是G-25葡聚糖凝胶柱，蛋白质应该先被洗脱下来，可是我每次过柱子，用280nm下测蛋白质吸光度，可是测出的结果是蛋白质在后边洗脱下来，而且没有明显的差别，洗脱的每一瓶里都有一定量的蛋白质，我是不是过柱子时出现了什么问题，或者装柱子时出现了问题，问什么结果会这样？希望有高人指点一下，我现在是极度的需要解答！
最近看了一些信息，凝胶必须经过脱气处理，否则柱效会很差，我没有经过脱气处理，溶胀之后直接装柱了，这个会对实验结果有什么影响啊？

[ Last edited by jixiao_02 on 2012-5-29 at 11:07 ]
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1楼 2012-05-29 11:01:21
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回帖置顶 ( 共有2个 )

danbomingyue

禁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, BioEPI+1, 鼓励发帖交流问题。 2012-05-29 20:05:07
第一，你应该检查一下，你的装柱，装胶后有没有压实，即用蠕动泵按照＞上样洗脱流速进行压柱，将填料压均匀。否则，柱效不好。
第二，你的样品浓度是不是很稀？上样体积是不是过大？
第三，至于溶胀，没有很大的关系，一般用常温纯水即可，溶胀时间24h；
第四，装胶的时候，一定不能分段添加，要将填料一次性添加进去，然后用蠕动泵或其他的动力装置用水压实。
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4楼2012-05-29 15:03:25
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danbomingyue

禁虫 (正式写手)
amisking: 回帖置顶 2012-05-29 20:05:13
本帖内容被屏蔽
7楼2012-05-29 16:26:59
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+4, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-05-29 20:04:56
据我个人看，你这有几方面问题，你去逐一检查。
首先，柱子有个分离的范围，分子量越大，越好分离。反而分子量小的，可能会和小分子一起下来。同时上样体积尽量小，在浓缩时候不沉淀为准。
其次，装柱要压实。同时如果你没有脱气处理的话，可以先用水冲洗至少1.2个柱体积再换上buffer，最后上样。
最后，针对你出现的问题，洗脱中每一瓶都有蛋白，我觉得装柱时候可能凝胶破损了，以至于蛋白从开始就一直流穿直到最后。
希望能帮到你。
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2楼2012-05-29 12:29:59
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dshlove

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by jixiao_02 at 2012-05-29 16:28:42
谢谢，我装凝胶的时候是沿着柱壁往下倒的，并且柱低有大约3cm的蒸馏水，这样装柱，凝胶会破碎吗？并且我的蛋白质是从动物里提取的混合物，是未知蛋白质，虽然每一瓶里都有蛋白质，但是在8、9的蛋白质吸收峰最高，这 ...

刚看你上面的回答了，柱子是要用泵去给压力，压实的，完全靠重力是不可能压实的。现在来看不是你凝胶破碎的问题了，你这柱子中可能还有空隙的，虽然你肉眼是看不到的。所以你的蛋白可能会聚集在某处，而不是均匀的走下来，某时间还会一起冲下来。而且，我不建议你将凝胶反复烘干使用。
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9楼2012-05-29 16:34:36
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一步一步

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by jixiao_02 at 2012-05-29 16:09:09
真的是非常感谢，但是我并没有蠕动泵，全靠重力的作用平衡柱子，怎样的柱子才算是压均匀了，这个不太懂唉，能不能再给说详细点。不好意思，我刚接触这个实验，好多不太明白。还有就是我上样的蛋白质的浓度是20mg/m ...

G-25柱是一个组群分离的柱子，目的是将蛋白质和小分子物质进行分离，主要被推荐用于含有球蛋白的组群分离。该柱料用于以分子量大于5000的分子中除盐和其他小分子污染物。
你的蛋白浓度在20mg/ml应该可以了。一般为了增加柱料的分辨能力，样品要浓缩。但是要避免浓度高于70mg/ml，因为粘度效应会干扰分离。
对于上样体积，要根据你柱子的柱体积而来。对于脱盐柱而言，最高上样量可达30%。
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13楼2012-05-30 08:44:01
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一步一步

木虫 (著名写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by jixiao_02 at 2012-05-31 09:31:43
我过柱子除的是分子量390的分子，应该是可以完全分来的，蛋白质应该在前边基本上全部洗脱下来吧，但是不知道为什么，蛋白质在每一管里都有，而后边小分子和蛋白质混合下来。有人建议我买一个蠕动泵，说用重力很难将 ...

如果每一个管中都有蛋白的话，那就是柱子柱效不好，装柱没装好啊。你可以尝试先看看装柱注意事项，并重新装柱。另外，建议你直接买GE lifesciences的PD-10柱，柱效绝对好，他们都是机器装柱，很好用的，至于价钱我不是很清楚，目前实验室用的还是之前别人买的。
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16楼2012-05-31 10:16:58
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一步一步

木虫 (著名写手)
我有一份关于关于柱效测定和装柱方法的资料，可以给楼主看看，忽然发现不知道怎么上传资料稍等。。。
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17楼2012-05-31 10:23:07
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普通回帖

lihuan0525

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
jixiao_02: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-05-29 16:09:32
楼主是怎么溶胀的，是用热水还是用的冷水，溶胀的时间多长
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3楼2012-05-29 13:52:48
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jixiao_02

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by danbomingyue at 2012-05-29 15:03:25
第一，你应该检查一下，你的装柱，装胶后有没有压实，即用蠕动泵按照＞上样洗脱流速进行压柱，将填料压均匀。否则，柱效不好。
第二，你的样品浓度是不是很稀？上样体积是不是过大？
第三，至于溶胀，没有很大的关 ...

真的是非常感谢，但是我并没有蠕动泵，全靠重力的作用平衡柱子，怎样的柱子才算是压均匀了，这个不太懂唉，能不能再给说详细点。不好意思，我刚接触这个实验，好多不太明白。还有就是我上样的蛋白质的浓度是20mg/ml，这个浓度不是很低吧，如果浓度太高会对结果有影响吗？蛋白质上样浓度在什么范围比较好啊？每次上样体积大约是1ml，上样体积大吗？感谢您！
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5楼2012-05-29 16:09:09
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jixiao_02

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lihuan0525 at 2012-05-29 13:52:48
楼主是怎么溶胀的，是用热水还是用的冷水，溶胀的时间多长

用的是热水溶胀的，2小时
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6楼2012-05-29 16:19:10
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jixiao_02

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2012-05-29 12:29:59
据我个人看，你这有几方面问题，你去逐一检查。
首先，柱子有个分离的范围，分子量越大，越好分离。反而分子量小的，可能会和小分子一起下来。同时上样体积尽量小，在浓缩时候不沉淀为准。
其次，装柱要压实。同时 ...

谢谢，我装凝胶的时候是沿着柱壁往下倒的，并且柱低有大约3cm的蒸馏水，这样装柱，凝胶会破碎吗？并且我的蛋白质是从动物里提取的混合物，是未知蛋白质，虽然每一瓶里都有蛋白质，但是在8、9的蛋白质吸收峰最高，这是为什么呢？还有就是我原来的凝胶柱子冲干净之后，我会将凝胶卸下来烘干，磨成粉末，凝胶颗粒真的很脆弱吗？这样凝胶颗粒会破裂吗？
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8楼2012-05-29 16:28:42
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jixiao_02

铜虫 (小有名气)
非常感谢各位的解答！！！
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10楼2012-05-29 16:55:31
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