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jixiao_02

铜虫 (小有名气)

[求助] 希望高人指点迷津,关于蛋白质葡聚糖凝胶过柱问题

我过凝胶柱过了好几遍了,用的是G-25葡聚糖凝胶柱,蛋白质应该先被洗脱下来,可是我每次过柱子,用280nm下测蛋白质吸光度,可是测出的结果是蛋白质在后边洗脱下来,而且没有明显的差别,洗脱的每一瓶里都有一定量的蛋白质,我是不是过柱子时出现了什么问题,或者装柱子时出现了问题,问什么结果会这样?希望有高人指点一下,我现在是极度的需要解答!
最近看了一些信息,凝胶必须经过脱气处理,否则柱效会很差,我没有经过脱气处理,溶胀之后直接装柱了,这个会对实验结果有什么影响啊?

[ Last edited by jixiao_02 on 2012-5-29 at 11:07 ]
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danbomingyue

禁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+3, BioEPI+1, 鼓励发帖交流问题。 2012-05-29 20:05:07
第一,你应该检查一下,你的装柱,装胶后有没有压实,即用蠕动泵按照>上样洗脱流速进行压柱,将填料压均匀。否则,柱效不好。
第二,你的样品浓度是不是很稀?上样体积是不是过大?
第三,至于溶胀,没有很大的关系,一般用常温纯水即可,溶胀时间24h;
第四,装胶的时候,一定不能分段添加,要将填料一次性添加进去,然后用蠕动泵或其他的动力装置用水压实。
4楼2012-05-29 15:03:25
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+4, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-05-29 20:04:56
据我个人看,你这有几方面问题,你去逐一检查。
首先,柱子有个分离的范围,分子量越大,越好分离。反而分子量小的,可能会和小分子一起下来。同时上样体积尽量小,在浓缩时候不沉淀为准。
其次,装柱要压实。同时如果你没有脱气处理的话,可以先用水冲洗至少1.2个柱体积再换上buffer,最后上样。
最后,针对你出现的问题,洗脱中每一瓶都有蛋白,我觉得装柱时候可能凝胶破损了,以至于蛋白从开始就一直流穿直到最后。
希望能帮到你。
2楼2012-05-29 12:29:59
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lihuan0525

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
jixiao_02: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-05-29 16:09:32
楼主是怎么溶胀的,是用热水还是用的冷水,溶胀的时间多长
3楼2012-05-29 13:52:48
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jixiao_02

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by danbomingyue at 2012-05-29 15:03:25
第一,你应该检查一下,你的装柱,装胶后有没有压实,即用蠕动泵按照>上样洗脱流速进行压柱,将填料压均匀。否则,柱效不好。
第二,你的样品浓度是不是很稀?上样体积是不是过大?
第三,至于溶胀,没有很大的关 ...

真的是非常感谢,但是我并没有蠕动泵,全靠重力的作用平衡柱子,怎样的柱子才算是压均匀了,这个不太懂唉,能不能再给说详细点。不好意思,我刚接触这个实验,好多不太明白。还有就是我上样的蛋白质的浓度是20mg/ml,这个浓度不是很低吧,如果浓度太高会对结果有影响吗?蛋白质上样浓度在什么范围比较好啊?每次上样体积大约是1ml,上样体积大吗?感谢您!
5楼2012-05-29 16:09:09
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