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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 希望高人指点迷津，关于蛋白质葡聚糖凝胶过柱问题
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jixiao_02

铜虫 (小有名气)

[求助] 希望高人指点迷津，关于蛋白质葡聚糖凝胶过柱问题

我过凝胶柱过了好几遍了，用的是G-25葡聚糖凝胶柱，蛋白质应该先被洗脱下来，可是我每次过柱子，用280nm下测蛋白质吸光度，可是测出的结果是蛋白质在后边洗脱下来，而且没有明显的差别，洗脱的每一瓶里都有一定量的蛋白质，我是不是过柱子时出现了什么问题，或者装柱子时出现了问题，问什么结果会这样？希望有高人指点一下，我现在是极度的需要解答！
最近看了一些信息，凝胶必须经过脱气处理，否则柱效会很差，我没有经过脱气处理，溶胀之后直接装柱了，这个会对实验结果有什么影响啊？

[ Last edited by jixiao_02 on 2012-5-29 at 11:07 ]
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1楼 2012-05-29 11:01:21
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jixiao_02

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by danbomingyue at 2012-05-29 15:03:25
第一，你应该检查一下，你的装柱，装胶后有没有压实，即用蠕动泵按照＞上样洗脱流速进行压柱，将填料压均匀。否则，柱效不好。
第二，你的样品浓度是不是很稀？上样体积是不是过大？
第三，至于溶胀，没有很大的关 ...

真的是非常感谢，但是我并没有蠕动泵，全靠重力的作用平衡柱子，怎样的柱子才算是压均匀了，这个不太懂唉，能不能再给说详细点。不好意思，我刚接触这个实验，好多不太明白。还有就是我上样的蛋白质的浓度是20mg/ml，这个浓度不是很低吧，如果浓度太高会对结果有影响吗？蛋白质上样浓度在什么范围比较好啊？每次上样体积大约是1ml，上样体积大吗？感谢您！
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5楼2012-05-29 16:09:09
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+4, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-05-29 20:04:56
据我个人看，你这有几方面问题，你去逐一检查。
首先，柱子有个分离的范围，分子量越大，越好分离。反而分子量小的，可能会和小分子一起下来。同时上样体积尽量小，在浓缩时候不沉淀为准。
其次，装柱要压实。同时如果你没有脱气处理的话，可以先用水冲洗至少1.2个柱体积再换上buffer，最后上样。
最后，针对你出现的问题，洗脱中每一瓶都有蛋白，我觉得装柱时候可能凝胶破损了，以至于蛋白从开始就一直流穿直到最后。
希望能帮到你。
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2楼2012-05-29 12:29:59
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lihuan0525

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
jixiao_02: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-05-29 16:09:32
楼主是怎么溶胀的，是用热水还是用的冷水，溶胀的时间多长
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3楼2012-05-29 13:52:48
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danbomingyue

禁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, BioEPI+1, 鼓励发帖交流问题。 2012-05-29 20:05:07
第一，你应该检查一下，你的装柱，装胶后有没有压实，即用蠕动泵按照＞上样洗脱流速进行压柱，将填料压均匀。否则，柱效不好。
第二，你的样品浓度是不是很稀？上样体积是不是过大？
第三，至于溶胀，没有很大的关系，一般用常温纯水即可，溶胀时间24h；
第四，装胶的时候，一定不能分段添加，要将填料一次性添加进去，然后用蠕动泵或其他的动力装置用水压实。
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4楼2012-05-29 15:03:25
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