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平末端加A尾连接T载体的问题 已有4人参与
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各位亲，打搅了 我现在有一段融合片段想要连接T载体，用的是primer star所以产物是平末端，因为同学都反应平末端连接效率低，所以想加A尾巴再连接T载体。 加A尾时用的是TAKARA的DNA A-Tailing Kit，加A尾的体系如下： buffer 5微 dNTP 4微 A-Tailing enzyme 0.5微 平末端DNA片段 约600ng（试剂盒的要求是达到0.5~5微克） 水 up to 50微 我的片段长度有3740bp，与T载体连接时间为：16度2个半小时。 转入DH5a后，在氨苄蓝白斑平板上筛选到白色的菌落进行菌落PCR、提质粒、酶切验证。 酶切的结果不理想，空载体的大小为2692bp，酶切得到的片段大小为3500bp左右，我想问的是： 1.有人说连接的片段大于载体的大小会很难连，是这样吗？ 2.酶切结果好像是只连上了一部分，是否是16度的反应时间太短？（说明书上写“长片段（2kb以上）进行克隆时，连接反应请延长至数小时。”咨询了TAKARA，说3740的片段要连多长时间，回复说不要超过3个小时。） 3.平末端连接是否还有更好的方法或者是经验，对于4000bp左右的平末端片段，怎样更有效的连上载体呢？ 谢谢各位。 |
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