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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 表达载体的链接
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lxh502976898

金虫 (小有名气)

[求助] 表达载体的链接

我第一次做目的片段和表达载体的连接，从pMD-18-T将目的片段切下连接到
PET-30a上，链接过夜后乙醇沉淀这一步就没有沉淀，也盲目的家TE溶解做转化，结果没有菌长出，请高手赐教。。。。谢谢
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1楼 2012-08-06 09:54:44
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

ghs25372216

禁虫 (正式写手)
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-06 15:10:38
本帖内容被屏蔽
2楼2012-08-06 11:09:51
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普通回帖

lxh502976898

金虫 (小有名气)
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2?: Originally posted by ghs25372216 at 2012-08-06 11:09:51
???????????????????к???????????????????10????????????7?????????1???????1????1???buffer??????????????????????????δ????????????????????TE??????????????????????? ...

你是用的T4连接酶???  怎么??按说明书???啊
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3楼2012-08-10 08:32:15
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lxh502976898

金虫 (小有名气)
???????:
2?: Originally posted by ghs25372216 at 2012-08-06 11:09:51
???????????????????к???????????????????10????????????7?????????1???????1????1???buffer??????????????????????????δ????????????????????TE??????????????????????? ...

你的回收浓度一般都多少ng啊 急需解决如何???高回收的浓度？
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4楼2012-08-10 08:48:48
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lxh502976898

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ghs25372216 at 2012-08-06 11:09:51
我都是在目的片段浓度和酶切后载体浓度比较浓的前提下，10微升连接体系：7微升目的片段1微升载体1微升酶1微升buffer，过夜连接，然后直接进行转化，从未用乙醇沉淀过，也为加过什么TE，一直结果都很好，呵呵，个人做 ...

你用的是T4连接酶吗 为什么不按说明书上的做  还有就是你的ng数一般多大啊 如何提高DNA回收的浓度 急需赐教
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5楼2012-08-10 08:57:59
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ghs25372216

禁虫 (正式写手)
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-10 13:51:03
本帖内容被屏蔽
6楼2012-08-10 10:13:27
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zy晨曦

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我平时用的是T4载体，10uL体系，16~20摄氏度，过夜连接
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日事日毕，日清日高
7楼2012-08-12 10:05:12
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lxh502976898

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by zy晨曦 at 2012-08-12 10:05:12
我平时用的是T4载体，10uL体系，16~20摄氏度，过夜连接

你的体系怎么安排的  目的基因和载体的量是多少  还有胶回收的浓度是多少  我每次回收的都挺低 急需帮助
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8楼2012-08-13 09:52:48
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zy晨曦

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

回收胶浓度：百分之一点二
10微升连接体系：7微升目的基因，1微升buffer，1微升载体，1微升酶
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日事日毕，日清日高
9楼2012-08-15 17:36:17
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xiemin217

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ghs25372216 at 2012-08-06 11:09:51
我都是在目的片段浓度和酶切后载体浓度比较浓的前提下，10微升连接体系：7微升目的片段1微升载体1微升酶1微升buffer，过夜连接，然后直接进行转化，从未用乙醇沉淀过，也为加过什么TE，一直结果都很好，呵呵，个人做 ...

，也是怎么干的，长的巨好，是手气好，呵呵
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10楼2012-08-15 20:36:57
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