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lxh502976898

金虫 (小有名气)

[求助] 表达载体的链接

我第一次做目的片段和表达载体的连接,从pMD-18-T将目的片段切下连接到
PET-30a上,链接过夜后乙醇沉淀这一步就没有沉淀,也盲目的家TE溶解做转化,结果没有菌长出,请高手赐教。。。。谢谢
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ghs25372216

禁虫 (正式写手)

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-06 15:10:38
本帖内容被屏蔽

2楼2012-08-06 11:09:51
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普通回帖

lxh502976898

金虫 (小有名气)

???????:
2?: Originally posted by ghs25372216 at 2012-08-06 11:09:51
???????????????????к???????????????????10????????????7?????????1???????1????1???buffer??????????????????????????δ????????????????????TE??????????????????????? ...

你是用的T4连接酶???  怎么??按说明书???啊
3楼2012-08-10 08:32:15
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lxh502976898

金虫 (小有名气)

???????:
2?: Originally posted by ghs25372216 at 2012-08-06 11:09:51
???????????????????к???????????????????10????????????7?????????1???????1????1???buffer??????????????????????????δ????????????????????TE??????????????????????? ...

你的回收浓度一般都多少ng啊 急需解决如何???高回收的浓度?
4楼2012-08-10 08:48:48
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lxh502976898

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by ghs25372216 at 2012-08-06 11:09:51
我都是在目的片段浓度和酶切后载体浓度比较浓的前提下,10微升连接体系:7微升目的片段1微升载体1微升酶1微升buffer,过夜连接,然后直接进行转化,从未用乙醇沉淀过,也为加过什么TE,一直结果都很好,呵呵,个人做 ...

你用的是T4连接酶吗 为什么不按说明书上的做  还有就是你的ng数一般多大啊 如何提高DNA回收的浓度 急需赐教
5楼2012-08-10 08:57:59
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ghs25372216

禁虫 (正式写手)

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-10 13:51:03
本帖内容被屏蔽

6楼2012-08-10 10:13:27
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zy晨曦

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我平时用的是T4载体,10uL体系,16~20摄氏度,过夜连接
日事日毕,日清日高
7楼2012-08-12 10:05:12
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lxh502976898

金虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by zy晨曦 at 2012-08-12 10:05:12
我平时用的是T4载体,10uL体系,16~20摄氏度,过夜连接

你的体系怎么安排的  目的基因和载体的量是多少  还有胶回收的浓度是多少  我每次回收的都挺低 急需帮助
8楼2012-08-13 09:52:48
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zy晨曦

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

回收胶浓度:百分之一点二
10微升连接体系:7微升目的基因,1微升buffer,1微升载体,1微升酶
日事日毕,日清日高
9楼2012-08-15 17:36:17
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xiemin217

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by ghs25372216 at 2012-08-06 11:09:51
我都是在目的片段浓度和酶切后载体浓度比较浓的前提下,10微升连接体系:7微升目的片段1微升载体1微升酶1微升buffer,过夜连接,然后直接进行转化,从未用乙醇沉淀过,也为加过什么TE,一直结果都很好,呵呵,个人做 ...

,也是怎么干的,长的巨好,是手气好,呵呵
10楼2012-08-15 20:36:57
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