应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 确定连接时载体，片段的加入量
51/1返回列表
查看: 4916  |  回复: 4
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 2 个 MolEPI ，点击这里进行查看

周志惠

新虫 (小有名气)

[求助] 确定连接时载体，片段的加入量

请各位帮忙确定一下连接体系，载体和片段的加入量，电泳图如下，载体是5.7kb,片段是2kb,T4连接酶，16℃
回复此楼

» 本帖附件资源列表

  • 欢迎监督和反馈：小木虫仅提供交流平台，不对该内容负责。
    本内容由用户自主发布，如果其内容涉及到知识产权问题，其责任在于用户本人，如对版权有异议，请联系邮箱：xiaomuchong@tal.com
  • 附件 1 : 连接比例-1-14.tif
    • 2013-01-15 09:26:14, 4.9 M

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

【分子生物】EPI帖

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-01-15 09:32:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有2个 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: MolEPI+1, 鼓励交流 2013-01-15 19:43:37
周志惠: 金币+5, ★有帮助 2013-01-16 10:02:38
用的什么marker，上样量多少？目的片段和载体片段各上了几微升？此外，你的目的片段明显上样量太大，从胶上很难估算浓度。你可以用软件对比marker分析浓度。最好条带的亮度与分子量相当的marker条带接近。
赞一下 回复此楼
2楼2013-01-15 09:58:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-01-15 11:53:36
1949stone: MolEPI+1, good 2013-01-15 19:43:13
周志惠: 金币+8, ★★★很有帮助 2013-01-16 10:04:25
首先，你得切胶回收，回收载体的5.7kb,还有片段的2kb。
片段如果是以质粒为模板PCR出来的，还要讲模板用限制性内切酶去消化，破坏模板的环状质粒。
然后，再做T4酶连接，具体量：
载体：片段=5:1---10:1，总体积不要超过10ul。
具体载体和片段的按照：1pmol  1000bp DNA=0.66ug去算，体积就是除以你回收后的浓度。
再加上等倍的酶去连接，再转化。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2013-01-15 10:21:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

周志惠

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-15 09:58:27
用的什么marker，上样量多少？目的片段和载体片段各上了几微升？此外，你的目的片段明显上样量太大，从胶上很难估算浓度。你可以用软件对比marker分析浓度。最好条带的亮度与分子量相当的marker条带接近。

Marker是λ-EcoT14Ⅰdigest  DNA Marker，上样量是5μL，目的片段和载体上样量是1μL
赞一下 回复此楼
4楼2013-01-15 14:36:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
周志惠: 金币+2 2013-01-16 10:04:55
引用回帖:
4楼: Originally posted by 周志惠 at 2013-01-15 14:36:27
Marker是λ-EcoT14Ⅰdigest  DNA Marker，上样量是5μL，目的片段和载体上样量是1μL...

3L给出了计算mol浓度的方法。我一般是载体用50ng，目的片段与载体分子数量的比例是3:1到4:1。根据碱基数目可以计算出目的片段所需要的ng数。然后按照浓度建立连接体系。
赞一下 回复此楼
5楼2013-01-15 16:09:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 周志惠 的主题更新
51/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料与化工一志愿南昌大学327求调剂推荐 +5 Ncdx123456 2026-03-13 6/300 2026-03-15 23:39 by lovewei0727
[考博] 东华理工大学化材专业26届硕士博士申请 +6 zlingli 2026-03-13 6/300 2026-03-15 20:00 by ryzcf
[考研] 326求调剂 +3 上岸的小葡 2026-03-15 4/200 2026-03-15 18:50 by 无际的草原
[考研] 化学工程321分求调剂 +5 大米饭！ 2026-03-15 5/250 2026-03-15 18:49 by a不易
[考研] 26考研一志愿中国石油大学(华东)305分求调剂 +3 嘉年新程 2026-03-15 3/150 2026-03-15 13:58 by 哈哈哈哈嘿嘿嘿
[考研] 255求调剂 +3 李嘉慧， 2026-03-12 4/200 2026-03-14 16:58 by 有只狸奴
[考研] 332分材料工程调剂 +3 莓好时光海苔 2026-03-09 3/150 2026-03-14 02:03 by JourneyLucky
[考研] 333求调剂 +3 球球古力 2026-03-09 3/150 2026-03-14 01:57 by JourneyLucky
[考研] 求调剂 +6 yfihxh 2026-03-09 6/300 2026-03-14 01:18 by JourneyLucky
[考研] 265求调剂 +9 小木虫085600 2026-03-09 12/600 2026-03-14 01:11 by JourneyLucky
[考研] 0856材料与化工301求调剂 +5 奕束光 2026-03-13 5/250 2026-03-13 22:00 by 星空星月
[考研] （081700）化学工程与技术-298分求调剂 +12 11啦啦啦 2026-03-11 35/1750 2026-03-13 21:25 by JourneyLucky
[考研] 材料工程调剂 +4 咪咪空空 2026-03-11 4/200 2026-03-13 19:57 by JourneyLucky
[考研] 【0856】化学工程（085602）313 分，本科学科评估A类院校化学工程与工艺，诚求调剂 +7 小刘快快上岸 2026-03-11 7/350 2026-03-13 16:06 by ruiyingmiao
[考研] 285求调剂 +4 ytter 2026-03-12 4/200 2026-03-13 14:48 by jxchenghu
[考研] 一志愿山大07化学 332分 四六级已过 本科山东双非 求调剂！ +3 不想理你 2026-03-12 3/150 2026-03-13 14:18 by JourneyLucky
[考研] 26考研求调剂 +5 丶宏Sir 2026-03-13 5/250 2026-03-13 13:05 by JourneyLucky
[考研] 277求调剂 +4 anchor17 2026-03-12 4/200 2026-03-13 11:15 by 白夜悠长
[考博] 读博申请 +5 感dd 2026-03-10 7/350 2026-03-11 17:02 by QGZDSYS
[硕博家园] 木虫好像不热闹了，是不是？ +4 偏振片 2026-03-10 4/200 2026-03-10 09:51 by longwave
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭