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周志惠新虫 (小有名气)
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[求助]
确定连接时载体，片段的加入量
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| 请各位帮忙确定一下连接体系，载体和片段的加入量，电泳图如下，载体是5.7kb,片段是2kb,T4连接酶，16℃ |
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2013-01-15 09:26:14, 4.9 M
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 【分子生物】EPI帖 |
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cicelyzh
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2楼2013-01-15 09:58:27
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-01-15 11:53:36
1949stone: MolEPI+1, good 2013-01-15 19:43:13
周志惠: 金币+8, ★★★很有帮助 2013-01-16 10:04:25
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周志惠: 金币+8, ★★★很有帮助 2013-01-16 10:04:25
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首先，你得切胶回收，回收载体的5.7kb,还有片段的2kb。 片段如果是以质粒为模板PCR出来的，还要讲模板用限制性内切酶去消化，破坏模板的环状质粒。 然后，再做T4酶连接，具体量： 载体：片段=5:1---10:1，总体积不要超过10ul。 具体载体和片段的按照：1pmol 1000bp DNA=0.66ug去算，体积就是除以你回收后的浓度。 再加上等倍的酶去连接，再转化。 |
3楼2013-01-15 10:21:11
周志惠
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4楼2013-01-15 14:36:27
cicelyzh
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5楼2013-01-15 16:09:58