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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 确定连接时载体，片段的加入量
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周志惠

新虫 (小有名气)

[求助] 确定连接时载体，片段的加入量

请各位帮忙确定一下连接体系，载体和片段的加入量，电泳图如下，载体是5.7kb,片段是2kb,T4连接酶，16℃
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    • 2013-01-15 09:26:14, 4.9 M

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1楼 2013-01-15 09:32:35
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回帖置顶 ( 共有2个 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: MolEPI+1, 鼓励交流 2013-01-15 19:43:37
周志惠: 金币+5, ★有帮助 2013-01-16 10:02:38
用的什么marker，上样量多少？目的片段和载体片段各上了几微升？此外，你的目的片段明显上样量太大，从胶上很难估算浓度。你可以用软件对比marker分析浓度。最好条带的亮度与分子量相当的marker条带接近。
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2楼2013-01-15 09:58:27
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-01-15 11:53:36
1949stone: MolEPI+1, good 2013-01-15 19:43:13
周志惠: 金币+8, ★★★很有帮助 2013-01-16 10:04:25
首先，你得切胶回收，回收载体的5.7kb,还有片段的2kb。
片段如果是以质粒为模板PCR出来的，还要讲模板用限制性内切酶去消化，破坏模板的环状质粒。
然后，再做T4酶连接，具体量：
载体：片段=5:1---10:1，总体积不要超过10ul。
具体载体和片段的按照：1pmol  1000bp DNA=0.66ug去算，体积就是除以你回收后的浓度。
再加上等倍的酶去连接，再转化。
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3楼2013-01-15 10:21:11
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普通回帖

周志惠

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-15 09:58:27
用的什么marker，上样量多少？目的片段和载体片段各上了几微升？此外，你的目的片段明显上样量太大，从胶上很难估算浓度。你可以用软件对比marker分析浓度。最好条带的亮度与分子量相当的marker条带接近。

Marker是λ-EcoT14Ⅰdigest  DNA Marker，上样量是5μL，目的片段和载体上样量是1μL
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4楼2013-01-15 14:36:27
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
周志惠: 金币+2 2013-01-16 10:04:55
引用回帖:
4楼: Originally posted by 周志惠 at 2013-01-15 14:36:27
Marker是λ-EcoT14Ⅰdigest  DNA Marker，上样量是5μL，目的片段和载体上样量是1μL...

3L给出了计算mol浓度的方法。我一般是载体用50ng，目的片段与载体分子数量的比例是3:1到4:1。根据碱基数目可以计算出目的片段所需要的ng数。然后按照浓度建立连接体系。
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5楼2013-01-15 16:09:58
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