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review

银虫 (著名写手)

应助: 24 (小学生)
金币: 903.6
散金: 57
帖子: 1355
在线: 265.5小时
虫号: 988088
注册: 2010-04-02
专业: 植物资源学

[交流] 克隆时做酶切，只切载体还是连要插入载体的片段也要酶切呢？已有5人参与

我的实验：扩增获得片段后连在载体上，再转到大肠杆菌里。
片段与载体连接时，是不是先给载体做个酶切？片段也要做吗片段已经加A了

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1楼 2012-10-10 16:29:44

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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

MolEPI: 5
应助: 131 (高中生)
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红花: 10
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在线: 88.3小时
虫号: 1067565
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性别: GG
专业: 质谱分析

★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 很全面了 2012-10-10 19:22:56

引用回帖:

4楼: Originally posted by review at 2012-10-10 17:19:42
设计引物时要考虑哪些？请指教谢谢了！我初学者...

引物设计原则：
1 引物长度大于16bp,一般为20-24个核苷酸
2 引物与靶序列间的Tm值不应过低
3 引物不应有发夹结构。即不能有4bp以上的回文序列
4 两引物间不应有大于4pb以上的互补序列或同源序列，在3’端不应有任何互补碱基
5 引物中碱基的分布尽可能均匀，G+C含量接近50%
此外，你如果要加入酶切位点还要考虑酶切位点的选择啊。
1 尽量不要选择载体上面的酶；
2 尽量选择常见、经济的酶；
3 选择多个酶时要保证有合适的共用bufer。

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持之以恒、永不放弃！

6楼2012-10-10 18:48:43

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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

MolEPI: 5
应助: 131 (高中生)
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红花: 10
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性别: GG
专业: 质谱分析

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1949stone: 金币+2, 鼓励一下 2012-10-10 16:51:44

既然要将你的目的片段连接到表达载体上，那你的载体和你的片段肯定都是要酶切的啊，你设计引物时就应该考虑了啊，而且这两次酶切用到的内切酶要一致，这样黏性末端才会互补，才能保证你后面可以连接上去啊！

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持之以恒、永不放弃！

2楼2012-10-10 16:41:10

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zy_rebecca

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 5.8
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在线: 1.1小时
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注册: 2012-10-10

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1949stone: 金币+1, 鼓励 2012-10-10 16:51:35

要的呀，要切出相同的粘性末端才能连接

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3楼2012-10-10 16:42:48

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review

银虫 (著名写手)

应助: 24 (小学生)
金币: 903.6
散金: 57
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虫号: 988088
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专业: 植物资源学

引用回帖:

2楼: Originally posted by gwd0312 at 2012-10-10 16:41:10
既然要将你的目的片段连接到表达载体上，那你的载体和你的片段肯定都是要酶切的啊，你设计引物时就应该考虑了啊，而且这两次酶切用到的内切酶要一致，这样黏性末端才会互补，才能保证你后面可以连接上去啊！

设计引物时要考虑哪些？请指教谢谢了！我初学者

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4楼2012-10-10 17:19:42

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