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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆时做酶切，只切载体还是连要插入载体的片段也要酶切呢？
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review

银虫 (著名写手)

[交流] 克隆时做酶切，只切载体还是连要插入载体的片段也要酶切呢？ 已有5人参与

我的实验：扩增获得片段后连在载体上，再转到大肠杆菌里。
片段与载体连接时，是不是先给载体做个酶切？片段也要做吗  片段已经加A了
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交流
1楼 2012-10-10 16:29:44
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回帖置顶 ( 共有1个 )

gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 很全面了 2012-10-10 19:22:56
引用回帖:
4楼: Originally posted by review at 2012-10-10 17:19:42
设计引物时要考虑哪些？请指教   谢谢了！  我初学者...

引物设计原则：
1 引物长度大于16bp,一般为20-24个核苷酸
2 引物与靶序列间的Tm值不应过低
3 引物不应有发夹结构。即不能有4bp以上的回文序列
4 两引物间不应有大于4pb以上的互补序列或同源序列，在3’端不应有任何互补碱基
5 引物中碱基的分布尽可能均匀，G+C含量接近50%
此外，你如果要加入酶切位点还要考虑酶切位点的选择啊。
1 尽量不要选择载体上面的酶；
2 尽量选择常见、经济的酶；
3 选择多个酶时要保证有合适的共用bufer。
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持之以恒、永不放弃！
6楼2012-10-10 18:48:43
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普通回帖

gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1949stone: 金币+2, 鼓励一下 2012-10-10 16:51:44
既然要将你的目的片段连接到表达载体上，那你的载体和你的片段肯定都是要酶切的啊，你设计引物时就应该考虑了啊，而且这两次酶切用到的内切酶要一致，这样黏性末端才会互补，才能保证你后面可以连接上去啊！
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持之以恒、永不放弃！
2楼2012-10-10 16:41:10
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zy_rebecca

新虫 (初入文坛)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1949stone: 金币+1, 鼓励 2012-10-10 16:51:35
要的呀，要切出相同的粘性末端才能连接
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3楼2012-10-10 16:42:48
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review

银虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gwd0312 at 2012-10-10 16:41:10
既然要将你的目的片段连接到表达载体上，那你的载体和你的片段肯定都是要酶切的啊，你设计引物时就应该考虑了啊，而且这两次酶切用到的内切酶要一致，这样黏性末端才会互补，才能保证你后面可以连接上去啊！

设计引物时要考虑哪些？请指教   谢谢了！  我初学者
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交流
4楼2012-10-10 17:19:42
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heyin89

禁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
5楼2012-10-10 17:28:18
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mamadexiao

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-11 15:53:56
加A的，你的载体是T载体么
是的话，就不用切，放一起直接连
要是连其他的载体的话，就片段和载体都切
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7楼2012-10-10 21:18:30
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-10-11 15:54:05
取决于你怎么连接了，TA还是用其他的RE做的
从你的描述中，可能是TA连接了。片段加A后不用，不过载体看你用的是预先处理的还是自己要处理的
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8楼2012-10-10 22:17:31
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