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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » pGEM-T载体连接大片段目的基因需要考虑的问题
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065316

金虫 (小有名气)

[求助] pGEM-T载体连接大片段目的基因需要考虑的问题已有3人参与

想要连接2000-4000大小的目的片段到promega的pGEM-T载体上，感受态是商业化的。目的基因是用TAKARA的primestar HS 扩增得到。之前看到连接大片段比较麻烦，我大概需要注意哪些问题呢，求各位指导，多谢！
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1楼2014-03-18 09:51:20
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065316

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
11楼: Originally posted by oylb at 2014-03-28 19:38:30
不会吧？PCR完了之后DNA都没有了？不可思议，那应该是其他环节问题。“14.5ul回收产物+3ul 10*buffer+2ul dNTP+0.5ul Taq酶”，为什么是3ul 而不是2ul buffer呢?不过这也不会导致DNA消失……

条带亮度不够？还是 ...

那应该是2ul 10*buffer+3ul dNTP？还看到一种做法是巢式PCR 30个循环之后拿出来直接加0.5ul的taq酶延伸10min,这也可以吧。
亮度可能是我之前回收的时候浓度就不大吧。
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12楼2014-03-28 22:38:20
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oylb

禁言 (正式写手)
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-03-18 14:58:10
本帖内容被屏蔽
2楼2014-03-18 11:18:14
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jjjhhbbb

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR产物多扩增一些，提纯，连接液体积稍微大一些
赞一下 回复此楼
3楼2014-03-18 15:19:47
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065316

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by oylb at 2014-03-18 11:18:14
大片段的连接反应，效率会略微低一些，增加连接时间、连接完成后4℃放置一定时间，都可以提高连接效率。应该是可以成功连接的。

primestar HS不能在PCR产物末端加A，所以不能连接到T载体上。必须要在扩增并回收完 ...

一般连接是4℃放置16h以上的。primestar HS PCR过后怎么用普通Taq加末端A？
赞一下 回复此楼
4楼2014-03-18 15:41:38
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