【答案】应助回帖

065316

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11楼: Originally posted by oylb at 2014-03-28 19:38:30
不会吧？PCR完了之后DNA都没有了？不可思议，那应该是其他环节问题。“14.5ul回收产物+3ul 10*buffer+2ul dNTP+0.5ul Taq酶”，为什么是3ul 而不是2ul buffer呢?不过这也不会导致DNA消失……

条带亮度不够？还是 ...

那应该是2ul 10*buffer+3ul dNTP？还看到一种做法是巢式PCR 30个循环之后拿出来直接加0.5ul的taq酶延伸10min,这也可以吧。
亮度可能是我之前回收的时候浓度就不大吧。

12楼2014-03-28 22:38:20

来冉冉

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那你现在克隆已经成功了吧，我现在我遇到你的问题，克隆3000bp平端片段，但是效率太低，目前还没有好的解决方案，求指点。

13楼2015-06-05 10:52:22

梓汐

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9楼: Originally posted by oylb at 2014-03-24 10:06:34
是的，PCR产物纯化的目的只是为了更换PCR的buffer。72℃延伸10min，基本上差不多了；你要是不放心，30min也行，虽然差别不大。...

是加胶回收产物做模板和上下游引物、mix 、水然后直接72℃延伸10min吗

14楼2015-06-06 20:57:54

sh_9153

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【答案】应助回帖

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10楼: Originally posted by 065316 at 2014-03-27 09:53:45
我试了一下，网上看到的。14.5ul回收产物+3ul 10*buffer+2ul dNTP+0.5ul Taq酶，混匀后72℃ 20min。跑胶发现条带亮度不是太够。做了两个样，另外一个居然没有了。...

你这是什么体系，按照正常体系混合就行，混合产物量加大

15楼2015-06-09 09:02:25