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pMD19-T双酶切，目的片段上酶切位点和载体上一样
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大家好，现在在构建转化载体双酶切上遇到点问题，请大家帮帮忙分析下： 我有两个目的片段A(800多bp)、B（600多bp），这两个片段用over-lapping pcr连在一起后连到了pMD19-T（2600多bp）上，我在B的一段（不是和A相连那段）设计了两个酶切位点xholI/BamHI（两个酶切位点间只相隔几个碱基）,现在用xholI/BamHI去切重组的T载体，这样再把我的第三个片段C（两端有酶切位点salI/BamHI）酶连到T载体上。可是对照pMD19-T的图谱后才发现，载体上也有BamHI这个酶切位点，现在我xholI/BamHI双酶切之后跑电泳出现三条条带大小分别是1400多、2600多、4000多！就想怎么会出现这样的情况，目的片段连到T载体上的方向性有两种可能，AB、BA，若是AB的话，那我双酶切之后应该就一条4000多的片段；若BA，则切下来的应该是两条1400多、2600多片段。现在有三条，难道是，我的质粒里有两种连接方向的T载体？可是我送菌液测序，给的序列就是AB连的情况啊！这是什么原因呢？还有在大肠中可能同时存在两种T载体么？ 求解答！ |
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如果是单克隆，不会存在两种T-载体，因为复制子完全相同，是竞争关系，根据质粒不相容原理，随着扩增有一个会消失。你确定筛选时挑的是单克隆吗？ 说了一堆，我觉得你的实验方案可能有问题。首先要问的是你设计XhoI/BamHI位点时，BamHI是否更靠近片段末端？如果是这样，是可以继续做的。如果XhoI在末端，你需要重新设计实验方案了。如果是前者，要解决的问题是当插入AB片段到T载体时，你需要筛选方向，也就是需要B片段上的BamHI靠近T载体上的BamHI。这样，用BamHI/XhoI双酶切时才能切出你要的末端和C片段连接。 以后做克隆前最好用软件设计方案，不要到筛选时才去查酶切位点。 |
2楼2013-11-20 14:03:56
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