| 查看: 4569 | 回复: 7 | ||
[求助]
pMD19-T双酶切，目的片段上酶切位点和载体上一样
|
|
大家好，现在在构建转化载体双酶切上遇到点问题，请大家帮帮忙分析下： 我有两个目的片段A(800多bp)、B（600多bp），这两个片段用over-lapping pcr连在一起后连到了pMD19-T（2600多bp）上，我在B的一段（不是和A相连那段）设计了两个酶切位点xholI/BamHI（两个酶切位点间只相隔几个碱基）,现在用xholI/BamHI去切重组的T载体，这样再把我的第三个片段C（两端有酶切位点salI/BamHI）酶连到T载体上。可是对照pMD19-T的图谱后才发现，载体上也有BamHI这个酶切位点，现在我xholI/BamHI双酶切之后跑电泳出现三条条带大小分别是1400多、2600多、4000多！就想怎么会出现这样的情况，目的片段连到T载体上的方向性有两种可能，AB、BA，若是AB的话，那我双酶切之后应该就一条4000多的片段；若BA，则切下来的应该是两条1400多、2600多片段。现在有三条，难道是，我的质粒里有两种连接方向的T载体？可是我送菌液测序，给的序列就是AB连的情况啊！这是什么原因呢？还有在大肠中可能同时存在两种T载体么？ 求解答！ |
回复此楼» 猜你喜欢
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有239人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有7人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂
已经有6人回复
-
化工申博
已经有3人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 克隆基因为什么一直连不到载体上
已经有11人回复
- 载体酶切位点与目的片段重复
已经有13人回复
- 纠结的分子实验，双酶切连不上，求助
已经有14人回复
- 片段总是连不到T载体上
已经有22人回复
- 目的片段和T载体连接后PCR条带诡异
已经有16人回复
- 载体上临近的两个酶切位点可以设计起来做双酶切吗？
已经有12人回复
- pMD18-T载体不需要酶切吗
已经有10人回复
- 求助设计引物加两个酶切位点
已经有10人回复
- 酶切位点不同，构建载体
已经有9人回复
- T载体连接问题
已经有3人回复
- 双酶切粘性末端连接不上
已经有21人回复
- PMD19-T载体连接不上428bp的片段
已经有20人回复
- pMD-19-T载体的大小是多少啊？
已经有9人回复
- 表达载体的构建
已经有17人回复
- 【求助】基因克隆T载体酶切问题等
已经有8人回复
- 质粒是否需要酶切后再电泳？
已经有9人回复
- 【求助/交流】Xhol 酶切不能切开
已经有13人回复
- 【求助/交流】菌液PCR和酶切的结果不符
已经有18人回复
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-20 19:58:32
苞谷芯: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-11-21 15:17:13
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-20 19:58:32
苞谷芯: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-11-21 15:17:13
|
如果是单克隆，不会存在两种T-载体，因为复制子完全相同，是竞争关系，根据质粒不相容原理，随着扩增有一个会消失。你确定筛选时挑的是单克隆吗？ 说了一堆，我觉得你的实验方案可能有问题。首先要问的是你设计XhoI/BamHI位点时，BamHI是否更靠近片段末端？如果是这样，是可以继续做的。如果XhoI在末端，你需要重新设计实验方案了。如果是前者，要解决的问题是当插入AB片段到T载体时，你需要筛选方向，也就是需要B片段上的BamHI靠近T载体上的BamHI。这样，用BamHI/XhoI双酶切时才能切出你要的末端和C片段连接。 以后做克隆前最好用软件设计方案，不要到筛选时才去查酶切位点。 |
2楼2013-11-20 14:03:56
huahu3600
新虫 (小有名气)
- 应助: 7 (幼儿园)
- 金币: 318.4
- 帖子: 113
- 在线: 68.2小时
- 虫号: 2793074
- 注册: 2013-11-11
- 专业: 遗传学研究新技术与方法
3楼2013-11-20 14:09:21
4楼2013-11-20 19:33:16
5楼2013-11-20 19:35:42
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
6楼2013-11-21 07:36:22
huahu3600
新虫 (小有名气)
- 应助: 7 (幼儿园)
- 金币: 318.4
- 帖子: 113
- 在线: 68.2小时
- 虫号: 2793074
- 注册: 2013-11-11
- 专业: 遗传学研究新技术与方法
7楼2013-11-21 12:07:07
8楼2013-11-21 15:16:22
