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longyh6411

金虫 (小有名气)

[求助] 载体上临近的两个酶切位点可以设计起来做双酶切吗?

载体上临近的两个酶切位点可以设计起来做双酶切吗?我没别的选择了,只能选挨着的
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cory0931

至尊木虫 (文坛精英)

巫山云

【答案】应助回帖

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感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 鼓励回帖交流! 2013-04-26 19:05:16
gyesang: 回帖置顶 2013-04-26 19:05:36
longyh6411: 金币+48, 有帮助 2013-09-18 16:17:47
on yr re:
质粒的两个酶切位点,紧挨着的话,势必会影响双酶切效果,原因是:
内切酶结合时,一般都是需要微点周围有多余碱基,否则影响结合;
再者,酶切后的粘性末端不余怒重合;
若是连个酶切位点之间有几个碱基的间隔,比如说6个以上,一般是可以的;
至少,也得间隔4个碱基吧;
若是直接没有间隔,目前貌似没有多少成功的文献可循;
锤之千古
10楼2013-04-26 17:37:15
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普通回帖

酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-04-24 20:20:08
这的看具体情况,一般来说,不建议用紧邻的两个酶切位点,可能影响其中一个的酶切效率。但也需要具体情况来分析,如果可能,将你的具体序列发上来,大家帮你分析
2楼2013-04-23 21:46:31
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XOooZzz

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-04-23 21:58:19
什么酶切位点?把序列发上来。
做是可以,不过建议酶切后用CIAP处理,以防止里面的单酶切片段自连。
3楼2013-04-23 21:54:19
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流! 2013-04-24 20:20:22
要根据距离和哪种限制酶的情况而定。有些能切开,有些不行。
4楼2013-04-24 03:59:14
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jwucn

至尊木虫 (文坛精英)

..........................帮您顶一个...................................
5楼2013-04-24 07:28:03
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zqxabc

木虫 (小有名气)


longyh6411(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天鼓励虫子来到生物版块交流,期待你的精彩1 2013-04-25 18:23:22
可以的,临近的两个酶切位点可以分步酶切,一个一个切,先切一个,然后不跑胶直接加Binding buffer过柱洗脱,回收产物再进行下一个酶切。因分步酶切有损耗,所以质粒的量可以增加以保证回收浓度

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
6楼2013-04-24 08:09:44
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
longyh6411(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,鼓励应助,分子生物版块期待你的更多精彩。同样期待你更详细的应助指导。 2013-04-25 18:23:35
尽量不要,临近位点可能导致一个酶的结合影响另一个酶的结合,还有就是有些酶需要的结合片段较长,分步酶切后也不一定能够实现
7楼2013-04-24 08:30:35
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山水88

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,鼓励应助,分子生物版块期待你的更多精彩。同样期待你更详细的应助指导。 2013-04-25 18:23:47
可以的话把序列放上来大家给你分析吧
8楼2013-04-24 08:41:22
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...山雨

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
这样子不好,酶切的效果好需要一定长度是保护碱基,挨着的位点切不动,分步切的话,buffer不一样,效果也非常一般,建议在引物上加酶切位点,这样就不受载体的限制了。
9楼2013-04-26 16:49:41
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