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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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lezhen_22

铁虫 (初入文坛)

[交流] 有关NEB内切酶NdeI和XhoI的双酶切问题 已有4人参与

有用过NEB内切酶NdeI和XhoI双酶切的大侠吗,请高手指点,用该两种酶来切空载体,需要多长时间。如果切目的片段呢,我的目的片段的两个酶切位点前都只有两个保护碱基,会不会效率很低,需要切多长时间?
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酶切专家

金虫 (小有名气)

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kx444555: 金币+3, 很详细 2013-03-18 18:07:38
一般来说,两个保护碱基就足够了。
关于双酶切设计,我建议你使用double digestion designer,http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/showresult.php
,可以根据你质粒或者PCR产物的大小和质粒的质量,精确计算完全酶切所需要的酶量,不用担心酶切不完全,当然,前提是你的酶保存恰当,没有失活,质粒的质量也没问题。
祝好运!
2楼2013-03-13 22:00:10
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gyesang

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
根据网上流传的保护碱基表,你的酶切位点前只有两个保护碱基对NdeI可能恐怕不够,你可以将PCR产物先克隆到T载体或其他克隆载体上,然后再进行酶切构建载体。

学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2013-03-14 00:13:19
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26264716

铁虫 (小有名气)


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引用回帖:
2楼: Originally posted by 酶切专家 at 2013-03-13 22:00:10
一般来说,两个保护碱基就足够了。
关于双酶切设计,我建议你使用double digestion designer,http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/showresult.php
,可以根据你质粒或者PCR产物的大小和质粒的质量,精确计算完全 ...

这个只有两周的免费使用啊。。。
苦,才是人生
4楼2013-03-15 12:52:24
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淡竹2066

铜虫 (小有名气)


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3楼: Originally posted by gyesang at 2013-03-14 00:13:19
根据网上流传的保护碱基表,你的酶切位点前只有两个保护碱基对NdeI可能恐怕不够,你可以将PCR产物先克隆到T载体或其他克隆载体上,然后再进行酶切构建载体。

楼主注意哦,NdeI切割效率为75%时的保护碱基含有EcoRI的酶切位点GAATTC
5楼2013-03-17 20:42:43
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gyesang

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5楼: Originally posted by 淡竹2066 at 2013-03-17 20:42:43
楼主注意哦,NdeI切割效率为75%时的保护碱基含有EcoRI的酶切位点GAATTC...

我觉得你好像对保护碱基理解有误,保护碱基的个数比保护碱基的类型重要。比如NdeI当需要达到75%的酶切效率时,其酶切位点需要距离DNA末端8个碱基,而不是保护序列里面需要EcoRI位点
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
6楼2013-03-17 21:32:50
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淡竹2066

铜虫 (小有名气)


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6楼: Originally posted by gyesang at 2013-03-17 21:32:50
我觉得你好像对保护碱基理解有误,保护碱基的个数比保护碱基的类型重要。比如NdeI当需要达到75%的酶切效率时,其酶切位点需要距离DNA末端8个碱基,而不是保护序列里面需要EcoRI位点...

我明白了,谢谢!
我之前用NdeI和EcoRI双酶切后连接就老是连不上,后来发现NdeI的保护碱基里面含有EcoRI,所以以为是保护碱基有问题,就换了酶切位点才连上的。
7楼2013-03-19 10:12:31
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