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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有关NEB内切酶NdeI和XhoI的双酶切问题
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lezhen_22

铁虫 (初入文坛)

[交流] 有关NEB内切酶NdeI和XhoI的双酶切问题 已有4人参与

有用过NEB内切酶NdeI和XhoI双酶切的大侠吗，请高手指点，用该两种酶来切空载体，需要多长时间。如果切目的片段呢，我的目的片段的两个酶切位点前都只有两个保护碱基，会不会效率很低，需要切多长时间？
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1楼 2013-03-13 15:38:45
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酶切专家

金虫 (小有名气)
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kx444555: 金币+3, 很详细 2013-03-18 18:07:38
一般来说，两个保护碱基就足够了。
关于双酶切设计，我建议你使用double digestion designer，http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/showresult.php
，可以根据你质粒或者PCR产物的大小和质粒的质量，精确计算完全酶切所需要的酶量，不用担心酶切不完全，当然，前提是你的酶保存恰当，没有失活，质粒的质量也没问题。
祝好运！
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2楼2013-03-13 22:00:10
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gyesang

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根据网上流传的保护碱基表，你的酶切位点前只有两个保护碱基对NdeI可能恐怕不够，你可以将PCR产物先克隆到T载体或其他克隆载体上，然后再进行酶切构建载体。
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3楼2013-03-14 00:13:19
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26264716

铁虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by 酶切专家 at 2013-03-13 22:00:10
一般来说，两个保护碱基就足够了。
关于双酶切设计，我建议你使用double digestion designer，http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/showresult.php
，可以根据你质粒或者PCR产物的大小和质粒的质量，精确计算完全 ...

这个只有两周的免费使用啊。。。
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苦，才是人生
4楼2013-03-15 12:52:24
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淡竹2066

铜虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by gyesang at 2013-03-14 00:13:19
根据网上流传的保护碱基表，你的酶切位点前只有两个保护碱基对NdeI可能恐怕不够，你可以将PCR产物先克隆到T载体或其他克隆载体上，然后再进行酶切构建载体。

楼主注意哦，NdeI切割效率为75%时的保护碱基含有EcoRI的酶切位点GAATTC
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5楼2013-03-17 20:42:43
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gyesang

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5楼: Originally posted by 淡竹2066 at 2013-03-17 20:42:43
楼主注意哦，NdeI切割效率为75%时的保护碱基含有EcoRI的酶切位点GAATTC...

我觉得你好像对保护碱基理解有误，保护碱基的个数比保护碱基的类型重要。比如NdeI当需要达到75%的酶切效率时，其酶切位点需要距离DNA末端8个碱基，而不是保护序列里面需要EcoRI位点
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6楼2013-03-17 21:32:50
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淡竹2066

铜虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by gyesang at 2013-03-17 21:32:50
我觉得你好像对保护碱基理解有误，保护碱基的个数比保护碱基的类型重要。比如NdeI当需要达到75%的酶切效率时，其酶切位点需要距离DNA末端8个碱基，而不是保护序列里面需要EcoRI位点...

我明白了，谢谢！
我之前用NdeI和EcoRI双酶切后连接就老是连不上，后来发现NdeI的保护碱基里面含有EcoRI，所以以为是保护碱基有问题，就换了酶切位点才连上的。
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7楼2013-03-19 10:12:31
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