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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pMD19-T双酶切，目的片段上酶切位点和载体上一样
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苞谷芯

新虫 (初入文坛)

[求助] pMD19-T双酶切，目的片段上酶切位点和载体上一样

大家好，现在在构建转化载体双酶切上遇到点问题，请大家帮帮忙分析下：
    我有两个目的片段A(800多bp)、B（600多bp），这两个片段用over-lapping pcr连在一起后连到了pMD19-T（2600多bp）上，我在B的一段（不是和A相连那段）设计了两个酶切位点xholI/BamHI（两个酶切位点间只相隔几个碱基）,现在用xholI/BamHI去切重组的T载体，这样再把我的第三个片段C（两端有酶切位点salI/BamHI）酶连到T载体上。可是对照pMD19-T的图谱后才发现，载体上也有BamHI这个酶切位点，现在我xholI/BamHI双酶切之后跑电泳出现三条条带大小分别是1400多、2600多、4000多！就想怎么会出现这样的情况，目的片段连到T载体上的方向性有两种可能，AB、BA，若是AB的话，那我双酶切之后应该就一条4000多的片段；若BA，则切下来的应该是两条1400多、2600多片段。现在有三条，难道是，我的质粒里有两种连接方向的T载体？可是我送菌液测序，给的序列就是AB连的情况啊！这是什么原因呢？还有在大肠中可能同时存在两种T载体么？ 求解答！
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1楼 2013-11-20 10:06:53
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-20 19:58:32
苞谷芯: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-11-21 15:17:13
如果是单克隆，不会存在两种T-载体，因为复制子完全相同，是竞争关系，根据质粒不相容原理，随着扩增有一个会消失。你确定筛选时挑的是单克隆吗？
说了一堆，我觉得你的实验方案可能有问题。首先要问的是你设计XhoI/BamHI位点时，BamHI是否更靠近片段末端？如果是这样，是可以继续做的。如果XhoI在末端，你需要重新设计实验方案了。如果是前者，要解决的问题是当插入AB片段到T载体时，你需要筛选方向，也就是需要B片段上的BamHI靠近T载体上的BamHI。这样，用BamHI/XhoI双酶切时才能切出你要的末端和C片段连接。
以后做克隆前最好用软件设计方案，不要到筛选时才去查酶切位点。
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2楼2013-11-20 14:03:56
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huahu3600

新虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-20 19:58:41
给你个建议，用BamHI单酶切。若只有4000多的片段，则是AB;若有1400,2600两个片段的话，则是BA。如果还是1400,2600,4000三条的话，会不会是克隆污染了？同时存在两种载体，没遇见呀
双酶切的话，搞不清楚谁发生了作用，是不是酶切完全等等。
供你参考
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3楼2013-11-20 14:09:21
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苞谷芯

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-20 14:03:56
如果是单克隆，不会存在两种T-载体，因为复制子完全相同，是竞争关系，根据质粒不相容原理，随着扩增有一个会消失。你确定筛选时挑的是单克隆吗？
说了一堆，我觉得你的实验方案可能有问题。首先要问的是你设计Xho ...

BamHI是靠近B末端的，今天将测序结果又比对了一遍，结果是目的片段上的BamHI是在离T载体上的BamHI远的那一端的，所以才会出现三条带（4000多那条应该是酶切不完全造成的~），现在还是想将C连到这个载体上。我想试试先单酶切的方法，就是：先用XholI对载体进行单酶切，然后在加BamHI进行不完全酶切，终止反应后，跑电泳，会有1400多、2600多和4000多的条带，4000多的片段应该就是我要的片段吧~
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4楼2013-11-20 19:33:16
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苞谷芯

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by huahu3600 at 2013-11-20 14:09:21
给你个建议，用BamHI单酶切。若只有4000多的片段，则是AB;若有1400,2600两个片段的话，则是BA。如果还是1400,2600,4000三条的话，会不会是克隆污染了？同时存在两种载体，没遇见呀
双酶切的话，搞不清楚谁发生了作 ...

今天对比了一下测序结果，是BA，出现三条带应该是酶切不完全~我想用两次单酶切看看能不能得到我要的片段
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5楼2013-11-20 19:35:42
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 苞谷芯 at 2013-11-20 19:33:16
BamHI是靠近B末端的，今天将测序结果又比对了一遍，结果是目的片段上的BamHI是在离T载体上的BamHI远的那一端的，所以才会出现三条带（4000多那条应该是酶切不完全造成的~），现在还是想将C连到这个载体上。我想试试 ...

做克隆这样是不行的。虽然不完全酶切可能得到你要的片段，也就是BamHI只切开一个位点。而且是你要的那一个，这样的概率不高。如果回收到错误的片段，或者是混合物，会给你后面的克隆带筛选来非常大的麻烦。为什么不筛一下T载体插入的正反，选择正确的方向的插入，就没有这么麻烦的。当酶切完全时做下面的连接，筛到正确克隆非常容易，也很快。
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6楼2013-11-21 07:36:22
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huahu3600

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-21 07:36:22
做克隆这样是不行的。虽然不完全酶切可能得到你要的片段，也就是BamHI只切开一个位点。而且是你要的那一个，这样的概率不高。如果回收到错误的片段，或者是混合物，会给你后面的克隆带筛选来非常大的麻烦。为什么不 ...

楼上正解。
一定得确定好现在的连接序列。这样才能决定把C片段往哪个位置装，不然，后患无穷。现在恐怕不能用XhoI+BamHI了，因为你的B末端的BamHI跟T载体冲突了。你可以一端用XhoI,另一端用利用T载体装入端上有而C片段没有的酶切位点。这些本应该设计阶段就考虑好的。加油吧！
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7楼2013-11-21 12:07:07
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苞谷芯

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by huahu3600 at 2013-11-21 12:07:07
楼上正解。
一定得确定好现在的连接序列。这样才能决定把C片段往哪个位置装，不然，后患无穷。现在恐怕不能用XhoI+BamHI了，因为你的B末端的BamHI跟T载体冲突了。你可以一端用XhoI,另一端用利用T载体装入端上有而 ...

恩，设计时疏忽了，bug很多，现在重新理顺调整
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8楼2013-11-21 15:16:22
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