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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助设计引物加两个酶切位点
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不鸣鸟

木虫 (正式写手)

[求助] 求助设计引物加两个酶切位点

要扩增一段1.6~1.7kb左右的目的基因，筛选出了一对效果比较好的引物：
上游：5‘-GTGATTATTCATTTCGGAGGGTG-3’
下游：5‘-CAGGGTTCTTAATACATACATTGCT-3’
现在不想用T载体的酶切位点，想用simple T  克隆。在目的基因5’端加XbaI 酶切位点，3‘端加SalI酶切位点
   SalI识别位点  5’-G’‘TCGAC-3'
                       3'-CAGCT,G-5'
   XbaI识别位点 5‘-T’‘CTAGA-3’
                       3‘-AGATC,T-5'


请指导一下具体怎么加，需要加保护碱基吗
或者教给我方法，有资料也可以
新手先谢谢啦
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1楼 2012-11-02 13:47:05
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
不鸣鸟: 金币+2 2012-11-06 07:38:03
加保护碱基http://www.dxy.cn/bbs/topic/2574 ... 4%E7%A2%B1%E5%9F%BA
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keepon
2楼2012-11-02 14:05:57
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不鸣鸟

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2012-11-02 14:05:57
加保护碱基http://www.dxy.cn/bbs/topic/2574172?keywords=%E4%BF%9D%E6%8A%A4%E7%A2%B1%E5%9F%BA

请教一下这个具体加到引物序列上是怎么加的，两个酶切位点加到哪
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3楼2012-11-02 14:13:07
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draco1987

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-05 20:13:46
不鸣鸟: 金币+2 2012-11-06 07:38:23
酶切位点当然要加在引物序列前面咯，也就是加在引物的5’端。保护碱基要查一下，楼上说过了。
不过楼主要注意啊，simple T有的也是有酶切位点的，我印象里Takara的pMD19-T simple本身就带了XbaI的酶切位点。
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4楼2012-11-02 15:51:28
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draco1987

木虫 (正式写手)
那个。。。实在不好意思，刚才我脑抽了，带XbaI酶切位点的是pMD19-T，不是simple
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5楼2012-11-02 15:59:59
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 不鸣鸟 at 2012-11-02 14:13:07
请教一下这个具体加到引物序列上是怎么加的，两个酶切位点加到哪...

酶切位点都是加载5’端啊。。。楼主这个都不知道。。。证明你ＰＣＲ原理都还不了解哦。。。多看看。。。
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keepon
6楼2012-11-02 20:57:25
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阿留申

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
不鸣鸟: 金币+2 2012-11-06 07:38:38
酶切位点家在引物的5'端就可以了，至于保护性碱基，如果你是想连到T载体上那就加不加都没什么关系，（保护性碱基是在直接将PCR产物进行酶切时发挥作用的）
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7楼2012-11-05 11:49:45
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xj0311

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

在5端加入保护碱基，直接加上就OK 了，
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8楼2012-11-05 13:57:48
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wangqi20092

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
不鸣鸟: 金币+2 2012-11-06 07:38:57
上游引物直接加上就行了，下游引物记得也是5‘-3’的方向，别搞错了，具体可以百度查看酶切位点表，酶切位点都是加在5’端。
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9楼2012-11-05 14:43:49
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xiaoyi-1988

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
不鸣鸟: 金币+2 2012-11-06 07:39:06
酶切位点都是加在引物的5‘端，保护碱基要加的，加在酶切位点前面就行
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风雨无悔，踏踏实实走好人生路上的每一步。
10楼2012-11-05 18:20:39
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