| 查看: 689 | 回复: 2 | |||
ottolzm木虫 (正式写手)
|
[交流]
【求助/交流】请教关于PCR的问题？谢谢各位大侠！！1 已有2人参与
|
| 最近刚刚开始做PCR实验，自学了一段时间。我的实验是我从NCBI中找到一株菌A中有我所想要的两段酶蛋白基因，然后我们实验室有A的相同种B，我首先利用酶蛋白的特异性底物在B的发酵液中检测到了酶蛋白的酶活，之后我根据A中的基因设计引物从B中进行PCR，但是做了一周了，PCR温度梯度，模板的浓度梯度均作了，只有在50度时，有微弱条带出现，而且非特异性条带很多（我用的引物是加了酶切位点的，因为之后想在大肠里质粒表达的），所以现在我怀疑还是我学艺不精，想向各位大侠请教一下，第一 引物设计的时候是按照所需片段直接设计好，还是在两头分别带上点序列进行设计好?第二 我连接的质粒上载C端由个HisTag 我想连上，所以我第一次设计引物的时候把序列的锁编码氨基酸C末端对应的终止密码子TGA给删掉之后设计的引物，我想问问这样会不会对引物的特异性造成影响？第三 各位大侠看看 是不是A和B的序列有所差别导致我的实验结果一直没有出现，还是我需要不带酶切位点设计引物先PCR出来片段在说后面的实验 加不加酶切位点对PCR的结果影响大吗？ 第四 在引物设计的时候，Tm和引物长度哪一个对特异性的影响较大？引物二聚体的自由能值在多少的范围内是正常的？错配位点有什么要注意的吗？ 谢谢各位大侠的帮助，希望大家多多交流，共同进步！！！ |
回复此楼» 猜你喜欢
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有216人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有8人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂
已经有6人回复
-
化工申博
已经有3人回复
2楼2010-05-27 10:23:28
ottolzm
木虫 (正式写手)
- 应助: 3 (幼儿园)
- 金币: 2850.6
- 散金: 22
- 红花: 6
- 帖子: 551
- 在线: 311.4小时
- 虫号: 630297
- 注册: 2008-10-19
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
3楼2010-05-28 08:43:46
