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ottolzm

木虫 (正式写手)

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[交流] 【求助/交流】请教关于PCR的问题？谢谢各位大侠！！1已有2人参与

最近刚刚开始做PCR实验，自学了一段时间。我的实验是我从NCBI中找到一株菌A中有我所想要的两段酶蛋白基因，然后我们实验室有A的相同种B，我首先利用酶蛋白的特异性底物在B的发酵液中检测到了酶蛋白的酶活，之后我根据A中的基因设计引物从B中进行PCR，但是做了一周了，PCR温度梯度，模板的浓度梯度均作了，只有在50度时，有微弱条带出现，而且非特异性条带很多（我用的引物是加了酶切位点的，因为之后想在大肠里质粒表达的），所以现在我怀疑还是我学艺不精，想向各位大侠请教一下，第一引物设计的时候是按照所需片段直接设计好，还是在两头分别带上点序列进行设计好?第二我连接的质粒上载C端由个HisTag 我想连上，所以我第一次设计引物的时候把序列的锁编码氨基酸C末端对应的终止密码子TGA给删掉之后设计的引物，我想问问这样会不会对引物的特异性造成影响？第三各位大侠看看是不是A和B的序列有所差别导致我的实验结果一直没有出现，还是我需要不带酶切位点设计引物先PCR出来片段在说后面的实验加不加酶切位点对PCR的结果影响大吗？第四在引物设计的时候，Tm和引物长度哪一个对特异性的影响较大？引物二聚体的自由能值在多少的范围内是正常的？错配位点有什么要注意的吗？谢谢各位大侠的帮助，希望大家多多交流，共同进步！！！

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