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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆基因为什么一直连不到载体上
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凉皮

铜虫 (初入文坛)

[求助] 克隆基因为什么一直连不到载体上

目的载体双酶切确定可以切开，含有同样酶切位点的目的片段先连到PMD19-T上的，之后把目的片段从PMD-19-T载体上切下来之后，却又连不到目的载体上了，究竟是什么原因呢?
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1楼2013-07-04 21:45:33
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lillian菲

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-05 15:04:38
你用的是T4连接酶吗？还有连接的时间温度都是需要注意的。还有载体和目的片段的浓度也是比较重要的，你看TA克隆试剂盒上都有详细说明的，你可以在做酶连之前测下各自的浓度是否符合说明书上的，然后再改进
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6楼2013-07-05 10:58:25
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武穆大成

木虫 (著名写手)

笨蛋

【答案】应助回帖

★
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myprayer: 金币+1, Gifts of roses, there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-07-04 22:18:52
1，载体和插入片段要有一定mol比。。否则很难连上去。，建议胶回收后分别测浓度，然后计算，载体0.03pmol。插入片段0.3pmol。。这样会很容易连
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2楼2013-07-04 21:58:15
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凉皮

铜虫 (初入文坛)
3楼2013-07-04 22:03:29
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-07-05 15:03:50
gyesang: 编辑内容 2013-07-06 19:06
能不能说的再详细一些，转化后没有菌落还是都是false positive？
你怎么确定你的目标载体是否是切好的呢？这个可能是关键

[ Last edited by gyesang on 2013-7-6 at 19:06 ]
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4楼2013-07-05 08:22:16
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grape_vine

金虫 (小有名气)

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引用回帖:
2楼: Originally posted by 武穆大成 at 2013-07-04 21:58:15
1，载体和插入片段要有一定mol比。。否则很难连上去。，建议胶回收后分别测浓度，然后计算，载体0.03pmol。插入片段0.3pmol。。这样会很容易连

摩尔比确实很重要.这个建议你可以去试.
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5楼2013-07-05 10:11:28
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
楼主应该至少说明是用什么酶，不然各位网友们不可能具体解答你的问题。
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7楼2013-07-05 11:33:02
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凉皮

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lwiaanngg at 2013-07-05 08:22:16
能不能说的再详细一些，转化后没有点或者是都是false positive？
你怎么确定你的目标载体是否是切好的呢？这个可能是关键

我把目标载体酶切1小时后，用未酶切的目标载体做对照，跑琼脂糖电泳胶，结果切后的产物是3条带，这不就证明是切开了。转化后都是目标载体自连的，没有连入目的基因的滞后的条带。但是该目的基因是可以连到PMD-19T载体上的，而且测序也验证了目的基因上的酶切位点没有突变的
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8楼2013-07-05 11:33:41
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王露1987

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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载体与片段比例要合适
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我是
9楼2013-07-05 18:57:07
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凉皮

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-07-05 11:33:02
楼主应该至少说明是用什么酶，不然各位网友们不可能具体解答你的问题。

我用得是DNA ligation kit 中的Solution I连接的。这个跟酶的关系很大吗？我T克隆都用得同样的酶连接成功的了。
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10楼2013-07-05 19:47:19
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