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克隆基因选取 菜鸟！！ 已有1人参与
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求问，我要克隆出一个蛋白。那个基因一共有15个产物，3个有csd。我用有的csd的那个蛋白blast之后取重复的那一段aa，用软件翻译成DNA之后想以此为目的基因。 现在遇到一个问题，我是菜鸟。 1、我拿到的DNA序列时简并序列，我要对照哪一个序列把它变成标准序列。 2、如果我查找不到启动子和终止子，是不是应该在PCR的时候把这些外加酶切位点一起P上去。 3、我要怎么控制开放阅读框是从哪一个开始阅读的呢？是在目标序列前面加3倍数的碱基，这样就能保证如果我在克隆载体中大量克隆后，表达载体就可以按照阅读框阅读。还是我因为在设计表达载体的时候才考虑？ 还有没有什么要注意，我之前有一个师兄设计的引物和序列，好像公司给回来的评价说产物太小，特异性不高，不然引物就要很长，很难成功。。他都没有成功跟克隆载体连接。。。 谢谢！ |
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 【分子生物】EPI帖 | 核酸方面 |
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cicelyzh
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小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 真是热心的虫虫啊，鼓励积极交流问题 2013-01-07 16:57:17
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1. 简并序列没有关系的。如果你是做蛋白表达，只要氨基酸序列对就可以了。主要是看密码子不能有表达宿主的稀有密码，否则表达效率上不去。 2. 不知道你想在什么载体和宿主里表达。无论怎样，一般的表达载体都有启动子和终止子，不需要原来基因的启动子和终止子，你只需要把序列从启动密码子到终止密码子这一段克隆出来就可以了。至于所加酶切位点，你需要根据所选的表达载体来设计。 3. 阅读框什么的没有关系的，翻译的时候是寻找启动子下游附近的ATG开始表达的。你主要设计好你的序列，从启动子到你的目的基因开头的一段最好只有一个ATG，否则可能会有多个翻译产物。 最后的问题问的不是很清楚，你是让公司给你克隆基因序列吗？如果只是合成引物，是否好用还是自己实验说了算吧。只要能克隆出正确序列就可以了。 |
2楼2013-01-07 03:20:16
3楼2013-01-07 15:23:35
cicelyzh
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4楼2013-01-08 07:58:15
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导师的想法是这样的，因为那个蛋白很多人都在做的是定位什么的，保守基因序列，是信号通路的重要一部分。所以他是想取多个产物的重复集合，类似做一类蛋白的抗体吧，上一个师兄取了4个产物的重复序列，就是35个aa，然后还原成的105个碱基。现在还在最开始，就是先把基因从人组织细胞中弄出来，大量克隆什么的。如果顺利的话，就会做表达，应该是用大肠杆菌表达的。 昨天我查了数据库，那个基因有15个转录产物，8个编码了蛋白。然后有3个是有CSD的。这三个蛋白的aa序列我blastp以后是有300多个连续重复的。 我现在搞不懂是按导师的想法，我是应该用尽可能多的蛋白产物来blast还是取其中几个呢？我查的大多数都是对前3个的研究。。 要是我要克隆300多个aa会很大么... 超级感谢~  |
5楼2013-01-08 10:51:23
cicelyzh
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做抗体可以不用全蛋白，只要表达蛋白的一段就可以了。而且如果是用保守区的话，可以识别多个的转录产物。我认为你导师的想法是针对几个重要的产物就可以了。虽然有那么多蛋白，可能有些表达量低或者功能方面没有那么重要。此外，我觉得最好是对全蛋白整个序列分析其抗原性。最好你要表达的区段抗原性比较强，做出来的抗体成功率高。你要克隆300多个aa的序列还不到1kb，不算大，是非常容易克隆的。我认为用反转录PCR的成功率很高的。如果可以P出来，回收PCR产物，克隆到载体里测序。如果序列正确就OK啦。 |
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xjtu00256楼2013-01-08 13:15:08
7楼2013-02-21 10:45:38
cicelyzh
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8楼2013-02-22 10:47:40
9楼2013-02-22 15:09:47
cicelyzh
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PCR产物包括引物序列，如果想克隆一个完整基因，5'引物一般就是从基因起始密码子（ATG）开始大致20个核苷酸，这20个左右nt是和模板完全互补的。如果要加酶切位点和保护碱基的话就在ATG前面加，这些核苷酸是与模板不互补的，计算引物Tm值时要去掉，只计算互补碱基。3'引物是一个道理。如果你不放心可以把序列发到我邮箱里cicelyzhang@hotmail.com 如果加了酶切位点，可以直接克隆到表达载体里。T载体是做TA克隆用，为了方便直接把taq DNA聚合酶P出来的片段直接连到载体。如果你做了酶切位点的话，没必要用T载体了。 |
10楼2013-02-23 07:36:01
