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tzaixmc木虫 (正式写手)
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基因克隆表达中信号肽的问题
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| 我最近想在大肠杆菌BL21中表达其他细菌的蛋白，用pet系列的载体。我的目的基因自身带有一段信号肽序列，我的目的是检测这种蛋白具有目的活性就行（不管是分泌型的还是不分泌的）。我想问的是我要设计引物的时候要去掉信号肽的部分吗？我可不可以选不带有信号肽的pet载体，把目的基因自身的信号肽也一起克隆进去？如果克隆进去的信号肽不能被切除是否会影响蛋白的活性？ |
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 分子问题及解决方案汇总 | 【分子生物】EPI帖 |
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lxj341401
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tzaixmc: 金币+5 2012-09-03 19:38:22
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tzaixmc: 金币+5 2012-09-03 19:38:22
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1、信号肽最好去掉，没有去掉的话很大的可能表达出来是没有活力的，因为宿主不能识别这个信号肽序列，不会把信号肽切割，表达出来的是带信号肽的蛋白，不是你要的成熟蛋白，对活性一般是有影响的。 2、不一定要选择带信号肽的质粒，你如果要让蛋白分泌的话可以选择pet20等，如果如果想融合表达的话pet32、39都可以，如果没有这些要求，pet28是个不错的选择。 |
4楼2012-09-03 10:01:37
lxj341401
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【答案】应助回帖
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小丹木木: 金币+3, 辛苦辛苦 2012-09-04 13:41:01
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1、转录肯定是从T7 promoter那儿开始。 2、转录有终止，T7 terminator。 3、翻译是是从Nde Ⅰ那儿的ATG开始，在BamH Ⅰ和Xh Ⅰ之间插入，即使ATG也是从Nde Ⅰ那儿的ATG开始翻译。 4、在BamH Ⅰ和Xh Ⅰ之间插入一段不带有TAA终止密码子的基因片段，如果没有移码，就是在你的TAA这里终止翻译。 5、你要用pet24的his-tag标签，就不能自己加终止密码子。 |
6楼2012-09-03 20:42:39
lxj341401
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8楼2012-09-04 09:22:43
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2楼2012-09-02 22:08:03
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3楼2012-09-03 09:55:21
tzaixmc
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还有一个问题就是以pet24为例，有关转录起始和终止位点，翻译起始和终止位点。 1.转录肯定是从T7 promoter那儿开始的吧？ 2.那转录有终止吗？细菌好像是单顺反子吧？ 3。翻译是在Nde Ⅰ那儿的ATG开始吧？我如果在BamH Ⅰ和Xh Ⅰ之间插入一段带有ATG位点的基因，也还是从Nde Ⅰ那儿的ATG开始翻译吧？ 4.我如果在BamH Ⅰ和Xh Ⅰ之间插入一段不带有TAA终止密码子的基因片段，那么是不是就是在T7 terminator的TAA终止翻译啊？那我的片段如果带有TAA终止密码子的话翻译就直接在我的插入片段的TAA这儿终止了吗？ 5.如果我想表达一段经分析带有信号肽的序列，我想除去信号肽的同时又不想带上载体的标签，我应该怎么做？是以除去信号肽后的第一个氨基酸的密码子开始设计带有Nde Ⅰ酶切位点的正向引物，再设计带有TAA终止密码子的并有合适酶切位点的反向引物来扩增插入片段吗？ |
5楼2012-09-03 19:57:54
tzaixmc
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还有几点不明白： 1.如果我的插入片段不带TAA，那是在His-tag后面的TGA那儿终止还是T7 terminator的TAA那儿终止？ 2.两种起始密码子GTG，ATG，三种终止密码子TAA，TAG，TGA密码子都能在pet载体中在BL21中被正确起始和终止吗？效率一样吗？ 3.关于上面的第5个问题，我不想要信号肽也不想要任何标签。那我就是利用Nde Ⅰ中的ATG起始翻译紧接着是去掉信号肽的成熟肽并带上基因自身的TAA。那实际上最后我的蛋白是去掉信号肽的部分但是N端还是带了ATG翻译出来的甲硫氨酸吧？那有没有什么策略可以得到单纯的成熟肽（其他载体可以带标签翻译出来再切掉）？推介一下 非常感谢！！ |
7楼2012-09-04 08:43:38
tzaixmc
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9楼2012-09-04 15:06:56
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10楼2012-09-04 17:44:16